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液相色谱（LC）

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主题：【求助】求助液相植物激素分析

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tianxinjianliuy

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发表于：2010/06/14 16:22:28 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

各位前辈，我的导师要求我使用液相分析植物中的激素含量；而本院没有人做过类似的实验，希望走过路过的大侠们，能够执教一下；提供一个好一点的方法。感激不尽，谢谢！

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2010/6/14 17:30:15 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

知道这个激素的成分吗？

植物内源激素测定方法研进展

0 引言

植物内源激素（Plant Endogenous Hormones)是指在植物体内合成的，通常从合成部位运往作用部位，在低浓度(1μmol/L以下)时对植物的生长发育产生显著调节作用的微量有机物质，主要有生长素类(AUXs)，赤霉素类(GAs)，细胞分裂素类(CTKs)，脱落酸(ABA)和乙烯(Eth)，人们习惯上称之为五大植物内源激素。内源激素在植物中的含量极低，每克鲜样中的含量为吲哚乙酸(IAA)10～100ng，GAs 1～1000ng，CTKs l～1000ng，ABA 10～4000ng，Eth 1～6000ng。内源激素对植物生长发育具有重要的调控作用，因而是植物生理学研究的主要对象。植物内源激素的精确测定对研究其在植物生命活动的调节作用具有非常重要的意义。植物内源激素含量低，性质不稳定，加之细胞中其他化合物的干扰，故测定的方法必须十分灵敏和专一，通常首先用合适的有机溶剂来提取，既要避免许多干扰物质，又要防止破坏内源激素本身，其次采用各种萃取或层析步骤，使内源激素得到部分提纯，然后再测定其含量。测定方法大致可以分为以早期简单的小麦胚芽鞘切段伸长法为代表的生物测定法、以气相色谱法(Gas Chromatography，GC)和高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)为代表的理化测定法，及以酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA)为代表的免疫测定法。

l 生物测定法

生物测定法是植物内源激素最早的测定方法，利用内源激素作用于植株或离体器官后所产生的生理生化效应的强度，推算出植物内源激素含量的方法。1928年Fritz Went建立了著名的燕麦芽鞘弯曲测定法，提出茎弯曲度与琼脂中生长素浓度成比例，但方法复杂、重复性差。1933年，Thimann KV和J Bonner对该方法进行了优化，建立燕麦叶鞘切断伸长法，用来测定生长素，简化了操作方法。此后，陆续建立了GAs，CTKs，ABA，Eth等内源激素的生物测定方法，如小麦胚芽鞘切断抑制法检测ABA、烟草髓愈伤组织鉴定法和胡萝卜根愈伤组织鉴定法鉴定CTK、矮生豌豆法、大麦胚芽鉴定法和点滴法鉴定GAs等。内源激素生物测定方法简便，并且可以反应内源激素活性，但专一性较差，灵敏度低，而且需要在前处理过程中将所要测定的内源激素组分尽可能纯化，使工作量加大，该方法目前主要用于植物生长调节剂筛选鉴定，很少用于内源激素含量的精确测定。

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2010/6/14 17:33:16 Last edit by xky0230699

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2010/6/14 17:33:48 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2 理化测定法

2.1 光谱测定法

最早应用光谱学测定植物内源激素的方法是对生长素的比色法测定。传统的的光谱法灵敏度和专一性较低，已很少被应用。现在常用以荧光技术为基础检测植物内源激素的新光谱法，例如利用赤霉素与浓硫酸作用生成三环芳烃衍生物在紫外光(260nm)下产生荧光以及ABA与浓硫酸沸水中加热后产生荧光、吲哚乙酸能与醋酸酐反应生成吲哚吡喃酮，均可以用荧光法进行测定。荧光法虽方法简便快速，灵敏度也很高，但植物内源激素的天然类似物也参与反应，且可能会有沉淀产生干扰测定，以及生成物光不稳定，要求测定快速、准时。另外还有X.Liu等用毛细管电泳将植物内源激素分离，对激光束聚焦到被测激素所产生的荧光光谱进行测定，检测最低浓度达2.8×10^-8mol/L。张韶虹等利用钉(II)配合物这类灵敏的化学发光试剂建立了一种化学发光直接检测IAA的新方法，该方法检出限为2×10^-3μg/ml。

2.2 色谱测定法

色谱测定法利用内源激素在不同介质中的分配系数不同，从而实现不同内源激素的分离并且进行测定的方法，早期多采用纸层析(Paper Chromatography，PPC)和薄层层析(Thin Layer Chromatography，TLC)，将植物样品分离再通过显色等方法进行测定，分离效率和灵敏度有限制，但设备简单，易操作，尤其TLC能方便地用于植物内源激素的分离、纯化、初步定性和半定量分析，常与其它方法结合使用，如陈以峰等曾报道用薄板层析和酶联免疫吸附法联用测定CTK。

气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)等是在PPC和TLC的基础上装备了商品化的色谱柱和检测器。由于该测定方法的专一、灵敏和准确，在20世纪60年代开始应用到植物内源激素测定后，发展迅速成为目前植物内源激素检测中常使用的技术。GC具有高灵敏度和专一性，可用于所有植物内源激素的分析，但前提都必须形成易挥发的衍生物才可以进行GC分析，李慧琳等用α-溴-2，3，4，5，6五氟甲苯衍生剂用气相色谱分离，电子捕获器测定LAA和ABA，最小检测限分别为10^-14g和10^-13g。杜黎明等建立了一种以530μm大口径毛细管气相色谱测定法，不需衍生化处理，直接进样，便可对IAA、ABA和萘乙酸(NAA)3种生长素同时测定，操作简便、定量准确，重现性好。而乙烯是唯一以气态存在的植物内源激素，因而主要运用GC测定。

HPLC法是较理想的植物内源激素的分析方法，除了乙烯外，其它内源激素均可以用HPLC法进行测定。选择合适的内源激素提取纯化方法、流动相、色谱柱和选用不同类型的检测器，不仅可以获得十分精确的结果，而且可以实现多种内源激素同时测定。徐爱军等建立了梯度洗脱高效液相色谱法测定5种植物内源激素的方法，检出限在0.02～0.3μg/g。离子色谱作为高效液相色谱的一种，被用来检测IAA，灵敏度可达0.73μg/ml(S/N=2.5)，这种方法较其它HPLC具有快速、灵敏等特点。HPLC的检测与GC不同，多数是非破坏性的，因此也常作为内源激素纯化的方法。

GC和HPLC方法分析植物内源激素需要复杂的前处理，昂贵的仪器设备以及熟练的技术人员，完成一次分析花时长和费用高，这些问题说明这两种方法已难以满足植物内源激素检测中大量样品的快速检测需要。因此人们迫切需要一种简单、快速及价廉的检测技术。

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2010/6/14 17:35:22 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3 免疫检测法

免疫学测定方法是十多年来得到迅速发展的植物内源激素测定方法，该方法有效地提高了检测的灵敏度，可检测出10^-12g的微量物质，简化了前处理步骤和大大缩短了分析流程。

放射免疫检测法(Radio Immunoassay，RIA)和酶联免疫吸附检测法(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays，ELISA)是当前常用的两种内源激素定量技术，其优点在于高专一性，高灵敏性，操作简便，样品往往只需初步纯化。周燮教授等报道了利用RIA检测技术测定ABA，该方法重复性好，准确度好，专一性强，但运用放射性物质，对实验操作人员以及环境都有影响。ELISA法应用于植物内源激素的测定具有前处理简便、测定快捷、灵敏度可达0.5ng/ml、特异性高的特点，适用于大批样品的测定，目前广泛应用于植物内源激素的研究测定(除Eth外)。

ELISA可分为两类：一是直接竞争法(固相抗体型），即游离抗原和酶标抗原与吸附抗体的竞争结合；二是间接法(固相抗原型)，即游离抗原和吸附抗原与游离抗体的竞争结合，加入酶的底物显色后，颜色深浅与酶的数量成正比，与标准抗原或未知抗原数量成反比。用H₂SO₄（或KOH）终止反应，在酶联免疫测定仪上于波长490nm处测定各孔的光密值，绘制标准曲线并计算各样品某种内源激素的含量。

免疫检测法主要问题在于抗体的制备较复杂。植物内源激素本身为不具免疫活性的半抗原，故需要先于牛血清蛋自(BSA)结合后形成完全抗原，再注入兔子等寄主体内来获得抗原抗体，所以内源激素的同系物、前体、类似物以及其他性质不明的化合物等存在不可避免地会出现交叉反应。现有人采用单克隆抗体技术(mAb)生产免疫测定中所需的抗体，解决了免疫测定中所使用抗体的多克隆性，提高了抗体的专一性。到目前为止，除乙烯外，其余四大类内源激素ELISA检测方法均已建立，并有成套的药盒出售。

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2010/6/14 17:35:59 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4 植物内源激素检测技术的发展方向

植物内源激素对植物生长和代谢的重要作用，使得对其进行精确定量检测和快速测定成为一项非常重要的工作。在上述传统的生物检测方法、理化检测方法以及免疫测定方法的基础上，植物内源激素检测技术不断改进，呈现多学科交叉发展的新方向。

4.1 应用生物技术改进传统的生物检测方法

Wout Boerjan等提出了一种全新的运用DNA重组技术检测IAA和CTK的定量生物检测法。他们将根癌农杆菌T-DNA gene5的启动子(Pg5)与GUS编码序列所组成的嵌合基因(Pg5-GUS)重组于章鱼碱T-DNA(pTiAch5)中。在IAA和CTK共同诱导下，通过检测基因表达量对IAA和CTK定量分析。该方法对IAA检测达到5×10^-8mol，反玉米素(trans-ZT)达5×10^-11mol。

4.2 理化检测法是主流，色质联用是趋势

气质联用(GC-MS)通过将质谱分析(Mass Spectrography，MS)与GC结合，为目前较为可靠的内源激素测定方法，Birkemeyer等基于检测多目标，运用此法检测出IAA、ABA和trans-ZT的精确度达0.01、0.3以及0.9 pmol。HPLC相比GC的薄弱环节在于其洗脱液中与样品的许多物质的物理性质接近，较难找到一种既通用灵敏度又高的检测器，将HPLC与MS联用能达到较好的效果。K.Hoyerov等运用高效液相色谱-串连质谱法(HPLC-MS/MS)分离和纯化细胞分裂素，并运用紫外检测器获得高比率具活性的细胞分离素。Ross等应用发相高效液相色谱与串连电喷雾离子质谱法对几种不同植物种ABA行检测，精确度达到0.89ng/g并在0～1.5ng间保持线性关系。通过二维高效液相色谱以及将HPLC与在线放射能检测器结合都实现了及时地检测植物内源激素的要求，这个突破对于快速检测植物代谢有巨大意义。日渐成熟的色谱-电喷雾串连质谱多反应检测法已被越来越广范应用于检测各种植物代谢中的植物内源激素。

4.3 新型免疫传感器检测法

最近，湖南农业大学植物激素重点实验室与湖南大学联合研制的植物激素免疫传感器是继色谱、质谱以及仪器联用、ELISA和RIA后，在植物激素测定方法领域的重大创新与突破。免疫传感器或免疫探针主要是利用抗原或抗体作为识别元件，通过抗体培育形成抗体－待测物结合体，由转换器将生物，化学信号转换成电信号，通过适当的方法进行直接或间接的定量检测。由于抗体抗原间的高亲和性，使免疫传感器具有高的灵敏性和选择性，并能快速、准确地进行在线分析。

4.4 免疫检测技术的逐步完善。

ELISA成为现今免疫检测植物内源激素的主要方法，但需要提高其交叉反应，提高检测水平。随着植物激素电化学免疫传感器的日益完善，其将有很大的反展空间。同ELISA一样，首要问题就是解决交叉反应的问题，而利用单克隆抗体以及植物激素的结合蛋白将是解决问题的一种方法。随着免疫RNA的发展，运用到植物激素检测中将开辟一个全新的领域。近期，有报道运用免疫层析技术和液相电喷雾质谱法结合的ABA检测方法，利用样品在免疫层析凝胶的高专一性和灵敏度使其成为一种新型方便，高效和灵敏的分离纯化方法。

作者单位：(安徽省农业科学院作物研究所，安徽省农作物品质改良重点实验室，合肥 230031)

文章采编：caisy

注明：国家科技支撑计划课题（2008BAD93B04）。

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