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主题：【讨论】新手关于TSK柱子的问题

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hnkjzyj
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发表于：2010/06/30 13:11:20 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
凝胶层析柱一般都是用蓝葡聚糖、重铬酸钾来标定内外水体积的，弱问下：TSK柱子使用的时候用标定下内外水体积吗？也就是关于TSK柱子的分离范围. TSK的柱体积怎么确定？...买的凝胶填料（Sephadex、Sepharose等）都有分子量范围，TSK柱子的分离范围怎么确定的？我现在手头有TSK G-4000PWxl、TSK G-2500PWxl...
    还有就是，TSK柱子上样量最大限是多少？我上次将TSK柱子接入到伊利特半制备上面了，上样0.2ml（样品量大概是1mg左右），分离出来是一个均一峰，分布很宽，有8min左右，是不是上样量太大的问题？
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2010/6/30 14:06:12 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
顶上去，在线等应助.....
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tigertooth
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2010/6/30 14:14:39 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一般不用标内外水体积，如果你测分子量的话，用标样做曲线就可以了。一根柱的柱体积大概12毫升左右，你看溶剂峰出来就可以算出来了。
GPC柱一般都是馒头峰，这与样品和柱子都有关系，200ul,1mg的样品不算多，很正常。
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海边
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2010/6/30 15:11:52 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
可以用溶剂峰或没有保留的物质来定位，通过保留时间及流量即可测算出。
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2010/6/30 15:36:56 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
但是，我把柱子链接在分析型液相上，得到的出峰时间大概是20min（0.3ml/min），也就是6ml左右，后来我连在了半制备上面，出峰时间大概是也是20min左右（0.5ml/min）也就是10ml左右，同一根柱子、同一个样品差别怎么这么大？？是因为半制备的死体积比较大导致的出峰后延吗？
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2010/6/30 15:42:03 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 海边(yxm0411) 发表:
可以用溶剂峰或没有保留的物质来定位，通过保留时间及流量即可测算出。


我没有看到上面溶剂峰啊？？？我的样品是多糖，然后没有特征吸收不能用紫外检测，用的是ELSD或者苯酚硫酸检测的.....
通过保留时间*流量得到的就是TSK柱子的外水体积呗？？？？
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2010/6/30 15:55:22 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 tigertooth(tigertooth) 发表:
一般不用标内外水体积，如果你测分子量的话，用标样做曲线就可以了。一根柱的柱体积大概12毫升左右，你看溶剂峰出来就可以算出来了。
GPC柱一般都是馒头峰，这与样品和柱子都有关系，200ul,1mg的样品不算多，很正常。

我看tosoh上面给的TSK G4000PWxl的应用图形，好像有些看起来也是挺尖的啊.....什么样的才算是馒头峰？平时洗脱的时候是不是1个柱体积基本上里面东西都已经洗出来了？
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2010/6/30 16:15:38 Last edit by hnkjzyj
柏坡
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2010/6/30 22:28:41 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
做分子量分布的时候很少有尖锐的峰出现，分子量在2W以上都比较钝。A的软件计算分子量是以流出体积计算。
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tigertooth
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2010/7/1 9:26:45 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你的流动相是等度还是梯度洗脱，如果是等度，道理上保留时间不会差这么多，但你还要考虑系统压力和流量准确性的问题。你所谓的半制备是指泵还是泵加检测器，如果只是泵，那死体积基本可以忽略不计，因为那只是泵头的原因，但半制备的泵一般流量稳定性不好，你还要查一查有没有漏的地方或泵流量的准确性。
如是梯度洗脱，那么泵和系统的的死体积就影响大了。
峰尖与不尖不是主要问题，关键看做的什么样品，PEG标样可能就峰比较尖，比较窄，但DEXTRAN一般就比较宽，峰尖处比较圆。但即便是PEG与普通HPLC的出峰比较，其峰宽和峰型也宽很多。我所为的馒头峰是与普通HPLC的峰比较而言。
溶剂峰一般用RI检测器才看得到，其它检测器是看不到的。
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hnkjzyj
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2010/7/1 11:21:47 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 tigertooth(tigertooth) 发表:
你的流动相是等度还是梯度洗脱，如果是等度，道理上保留时间不会差这么多，但你还要考虑系统压力和流量准确性的问题。你所谓的半制备是指泵还是泵加检测器，如果只是泵，那死体积基本可以忽略不计，因为那只是泵头的原因，但半制备的泵一般流量稳定性不好，你还要查一查有没有漏的地方或泵流量的准确性。
如是梯度洗脱，那么泵和系统的的死体积就影响大了。
峰尖与不尖不是主要问题，关键看做的什么样品，PEG标样可能就峰比较尖，比较窄，但DEXTRAN一般就比较宽，峰尖处比较圆。但即便是PEG与普通HPLC的出峰比较，其峰宽和峰型也宽很多。我所为的馒头峰是与普通HPLC的峰比较而言。
溶剂峰一般用RI检测器才看得到，其它检测器是看不到的。


谢谢tigertooth....
我也不清楚所谓的半制备是什么，只知道是半制备系统，平时上样量比分析型的要多好多，柱子一般都是自己填的...
我用的是等度洗脱，只用0.15M NaCl 洗脱，因为样品是多糖，没有特征吸收峰，所以采用自动收集器收集，然后苯酚-硫酸法测定的...
还有，就是同样的样品，我上TSK G4000PWxl柱子，显示的是一个很宽的均一峰，本来柱体积就小（大约应该是12ml左右吧，7.8*300mm柱子），但是多糖出峰的体积就有5ml左右，但是同一个样品我上Sepharose CL-6B层析柱，却看出来有好多杂峰，这是为什么？？？
莫非TSK分辨率还没有Sepharose的层析柱分辨率高？？？
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boykenneth
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2010/7/2 11:27:34 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 hnkjzyj(hnkjzyj) 发表:
但是，我把柱子链接在分析型液相上，得到的出峰时间大概是20min（0.3ml/min），也就是6ml左右，后来我连在了半制备上面，出峰时间大概是也是20min左右（0.5ml/min）也就是10ml左右，同一根柱子、同一个样品差别怎么这么大？？是因为半制备的死体积比较大导致的出峰后延吗？


制备设备和分析设备的管路内径是有区别的，实际上当色谱柱一连接到仪器上时，相关的死体积等因素就不该用色谱住单一去评论了，而是把仪器和色谱住整体当作一个系统去评价。就好比很不错的柱子却装在一套很差的设备上，那他会表现出很好的柱效么。
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