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原文由 plexu(plexu) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:原文由 plexu(plexu) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:
感谢月旭在本版面做论坛线上讲座！
您好！我有以下问题想请教：
1、对于一根常用的C18住，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？希望能够详细些，非常感激。
2、测定多肽，一般采用什么柱子？流动相是乙腈和水，还有微量的TFA。特别是像类似三肽的短肽，应该怎么选择柱子？
新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。
如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。
分子量不高的多肽一般选用常规C18柱就能测定，也有用离子交换柱、水性C18柱和Hilic亲水作用柱的。
非常感谢plexu的回答，还有一点不明白，就是记得以前拿到C18柱，会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化，这样做的目的是什么呢？是先用溶剂活化吗？然后再用样品？
还有测定短肽总是冲出来，该怎么解决呢？就是和溶剂峰出在一起，或者出在溶剂峰之前。
新柱子先用甲醇平衡，测定前再用流动相平衡，平衡的目的是测定前把基线走平，最后才是在正式测定前用样品去平衡（也可称饱和或老化）柱子。
短肽和溶剂峰差不多时间出来，很明显是保留不足的问题。解决极性物质在反相柱上保留不足的方法详见此帖：http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20091215/2270999/。一般的办法是：提高流动相中水相的比例，譬如用100水做流动相；调pH值使待测物处于分子态不电离；加离子对试剂（多肽和蛋白测定中一般加0.1%的TFA三氟乙酸）。
原文由 xue2009(xue2009) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:原文由 xue2009(xue2009) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:原文由 plexu(plexu) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教：
C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性环境中，会对柱子有什么损坏吗？ph在2左右。
pH2左右容易使键合在硅胶基质上的固定相水解流失，包括C18和封尾试剂的水解，封尾试剂相对更容易水解。不知道你保存的酸性环境是不是含有缓冲盐，如果不含缓冲盐，只是短期几天保存在酸性流动相中，也不必过份担心，最多相当于这几天一直在使用这根色谱柱，因此减少几天的使用寿命吧；有缓冲盐就麻烦一点，保存期间水分挥发可能会导致缓冲盐结晶在柱内析出，对柱子损伤很大。
没有缓冲盐的，那就好，但是对于峰形的问题还是很发愁，昨天还出了一个问题，同一个样品，在一台仪器上出来时分叉的峰，在另一台是一个峰，并且纯度还蛮高的，出封时间在8-10min，不知道咋办了，所用的条件应该是一样的
那就是两仪器柱子的问题咯，你用同一根柱子在两台仪器上做下看看
这倒是没试
因为仪器不是我们实验室滴
那柱子出了什么问题，会造成这样的结果呢？
是柱子的键合相流失的原因么？
一般是柱子脏了，或者固定相坍塌了，把柱子反冲下就好了，这个很容易搞定的
原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:
分叉峰有很多原因，但大部分是柱子筛板上有颗粒物堵塞的原因。你可以先简单将柱子反冲一下，如果分叉问题解决了，就什么都不用往深的想了。
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感谢月旭在本版面做论坛线上讲座！
您好！我有以下问题想请教：
1、对于一根常用的C18住，拿到一根新柱的时候应该怎样进行活化及维护？为什么要这样做？希望能够详细些，非常感激。
2、测定多肽，一般采用什么柱子？流动相是乙腈和水，还有微量的TFA。特别是像类似三肽的短肽，应该怎么选择柱子？
新柱活化，实际上是一个平衡的过程，除了用流动相平衡外，有时候还必须用所测样品对新柱进行平衡，特别是测定分子量比较高的多肽，尤其重要。因为分子量高的物质分子，扩散速度慢，平衡所需时间也相应较长。具体平衡方式也很简单，多进几次样品，直到峰面积和保留时间稳定，再进行正式进样测定。
如果要加快平衡时间，把前面用来平衡的进样样品浓度加大，或者不等洗脱完成，连续进样多针。用待测物对新柱平衡，目的是将硅胶基质填料表面具有非特异性吸附的位点的吸附能力饱和掉。
分子量不高的多肽一般选用常规C18柱就能测定，也有用离子交换柱、水性C18柱和Hilic亲水作用柱的。
非常感谢plexu的回答，还有一点不明白，就是记得以前拿到C18柱，会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化，这样做的目的是什么呢？是先用溶剂活化吗？然后再用样品？
还有测定短肽总是冲出来，该怎么解决呢？就是和溶剂峰出在一起，或者出在溶剂峰之前。
新柱子先用甲醇平衡，测定前再用流动相平衡，平衡的目的是测定前把基线走平，最后才是在正式测定前用样品去平衡（也可称饱和或老化）柱子。
短肽和溶剂峰差不多时间出来，很明显是保留不足的问题。解决极性物质在反相柱上保留不足的方法详见此帖：http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20091215/2270999/。一般的办法是：提高流动相中水相的比例，譬如用100水做流动相；调pH值使待测物处于分子态不电离；加离子对试剂（多肽和蛋白测定中一般加0.1%的TFA三氟乙酸）。
现在的流动相中都加的有TFA，用98水做流动相还是不行，100水的话不是对柱子不好么？
“调pH值使待测物处于分子态不电离；”这个不会做
原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:原文由 xue2009(xue2009) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:原文由 xue2009(xue2009) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:原文由 plexu(plexu) 发表:原文由 wkfei1128(wkfei1128) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教：
C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性环境中，会对柱子有什么损坏吗？ph在2左右。
pH2左右容易使键合在硅胶基质上的固定相水解流失，包括C18和封尾试剂的水解，封尾试剂相对更容易水解。不知道你保存的酸性环境是不是含有缓冲盐，如果不含缓冲盐，只是短期几天保存在酸性流动相中，也不必过份担心，最多相当于这几天一直在使用这根色谱柱，因此减少几天的使用寿命吧；有缓冲盐就麻烦一点，保存期间水分挥发可能会导致缓冲盐结晶在柱内析出，对柱子损伤很大。
没有缓冲盐的，那就好，但是对于峰形的问题还是很发愁，昨天还出了一个问题，同一个样品，在一台仪器上出来时分叉的峰，在另一台是一个峰，并且纯度还蛮高的，出封时间在8-10min，不知道咋办了，所用的条件应该是一样的
那就是两仪器柱子的问题咯，你用同一根柱子在两台仪器上做下看看
这倒是没试
因为仪器不是我们实验室滴
那柱子出了什么问题，会造成这样的结果呢？
是柱子的键合相流失的原因么？
一般是柱子脏了，或者固定相坍塌了，把柱子反冲下就好了，这个很容易搞定的
可是，那为什么走别的样就好好的呢？
还有没有是别的原因造成的呢？
反冲，一般选用什么试剂，有什么需要注意的吗？以前没有反冲过
原文由 plexu(plexu) 发表:原文由 plexu(plexu) 发表:原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
1、plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：磷酸盐缓冲盐渗透力强，为什么，是因为与醋酸盐，枸椽酸盐相比，基团小吗，使用磷酸盐缓冲液与其它缓冲液相比，会使色谱柱寿命缩短多少？
关于磷酸盐相对渗透性强的机理，我一直没有查到权威的解释（望坛内有知道的高手能出来解疑哦）。但用磷酸盐缓冲盐会影响硅胶基质色谱柱的寿命，业内已有定论。之所以还一直采用磷酸盐，因为下面三点
极好的紫外透光度，独特的峰形和色谱分离选择性，多个pKa值和很好的缓冲容量。
磷酸盐对硅胶基质色谱柱寿命影响还是很显著的，具体见Kirkland的经典书籍中的图例：
在磷酸盐存在下，柱温又高于40摄氏度，则对色谱柱影响更致命：
原来一直以为磷酸盐没那么厉害，只是在结晶上很容易堵塞管路，现在看来还是很严重的！
原文由 xue2009(xue2009) 发表:原文由 zxm-1980(zxm-1980) 发表:
plexu您好！我有以下问题想请教，
请问：如果液相色谱谱图基线漂移很大是不是柱子的问题？波长越小的越大，270nm的还不怎么能看出来，230nm的就非常厉害了，有可能是什么原因造成的？谢谢了！
你用什么流动相？有可能是你的流动相的问题，230可能已经快到你流动相的截止波长了，当然紫外吸收强，基线漂移厉害
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