主题：【分享】大肠菌群革兰氏染色技术的实验研究结果

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发表于：2010/08/11 17:20:19 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

在大肠菌群测定过程中，革兰氏染色（Gram Stain）又是一步很重要的鉴定阶段，革兰氏染色的正确性直接关系到能否正确判断该菌落是不是大肠菌群，而革兰氏染色正是一门难以掌握的最基本的细菌学实验技术，许多分析人员因缺少这方面熟练技术而显得对革兰氏染色结果没有把握，有的只好通过多次反复试验以求得一个仍不很肯定的判断结果，既浪费时间又不能保证染色结果是否正确，很可能还导致大肠菌群测定错误或失败，我们在多年的大肠菌群测定分析的实践基础上，通过纯培养一株大肠杆菌（Escherchiacoli ）和一株枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis）并进行多种条件下的革兰氏染色实验比较，以观察革兰氏染色易受哪些因素影响，从而进一步研究这项技术的最佳操作方法。1 实验材料
1.1 大肠杆菌
大肠杆菌是大肠菌群中很重要也很有代表性的一种．在某次大肠菌群测定过程中，选取伊红美兰琼脂培养基上不同的典型菌落，按《应用微生物学实验法户〕中大肠菌群细菌分离法得到甲基红试验阳性、VP 试验阴性、发酵柠檬酸盐阴性、利用脉酸试验阴性等特征的一株大肠杆菌．2 实验结果与分析
2.1菌龄的影响
16h 和24h的大肠杆菌和枯草芽抱杆菌革兰氏染色均能得到正确结果，但32h以上的枯草芽抱杆菌有13.3％出现阴性结果。出现阴性反应的枯草芽抱杆菌同时发现很多菌体已经不呈典型杆状，显然由于培养时间过长，枯草芽抱杆菌（阳性菌）或已死亡或部分菌自行溶解了，造成细胞壁通透性增大而呈假阴性。因此在大肠菌群测定时，细菌在伊红美兰琼脂培养基上培养时间不宜超过24h，以免阳性菌呈假阴性干扰革兰氏染色的正确性．
2.2细菌堆积密度影响
涂片时生理盐水中细菌浓厚时，菌体明显堆积在一起，从而影响酒精脱色效果，甚至在细菌堆中仍残留结晶紫，因而无论大肠杆菌还是枯草芽抱杆菌，凡密集成堆的常常呈阳性反应，而均匀分散的大肠杆菌和枯草芽抱杆菌都能得到正确结果，因此测定时应以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准．
我们认为在大肠菌群革兰氏染色时菌龄、细菌密集程度、媒染时间、酒精脱色程度这几方面因素会对染色的正确性产生影响．在大肠菌群测定时，革兰氏染色的最佳条件应该是：细菌在伊红美兰琼脂培养基上培养时间不宜超过24h ，涂片时应以分散开的细菌染色为准，碘媒染时间以1 min为宜，酒精脱色程度是革兰氏染色的关键，脱色时间应严格控制在2S 一30S之间。为进一步确证革兰氏染色操作正确，应把未知菌伊红美兰琼脂培养基上的典型菌落（cdony）与已知的大肠杆菌和枯草芽抱杆菌的混合菌同片染色，如果混合菌能分辨出阳性菌和阴性菌，则也能肯定未知菌革兰氏染色结果是正确的．

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