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主题：【求助】求助：用HPLC定量,得出无法解释的结果？

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lwjxzj
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发表于：2010/08/12 11:19:35 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第一次用HPLC定量,得出无法解释的结果,请各位大侠帮忙.

用A物质标准品(固体粉末),ddw制成0.5mg/ml溶液，分别进样5ul，10ul，15ul，20ul，25ul，30ul，50ul进行HPLC，根据标准品HPLC检测时的峰高，制得峰高与进样量关系的标准曲线y=31.286x+609.64(R2=0.98)。

将待测样品X（固体粉末），ddw制成0.5mg/ml溶液，进样10ul（质量为5ug），HPLC检测，A物质的峰高为1280.1，根据标准曲线的计算得HPCL检测的10ul X样品中A物质的含量为32ug,可是X物质进行HPLC检测时，进样总质量不过5ug,A物质在其中的含量怎么可能为32ug（〉5ug）呢？

目前，我能够想到的原因：

1，样品配置的时候出现了问题：
但是，A和X物质同时进行称量、配制，都是取20mg样品，溶于200ul ddw，配成100mg/ml母液，然后取5ul母液ddw稀释至1ml,配成0.5mg/ml的检测溶液。如果配制过程有问题，那么两种物质的溶液浓度就会都有问题，不会两者之间有这么大的差异。

2，X样品在A吸收峰的地方，还有另外一种物质的吸收峰：
但是，HPLC的条件（流动相中有机相和无机相的配比）做过多次改动，X物质中A物质出峰时间与A物质标准品的出峰时间总是一致的，没有看见X物质的A峰周围有其它峰出现；并且，X物质的A峰，很犀利，不像夹杂有其它物质。

不知道还有什么问题，我忽略掉了，没有注意，请各位大侠指点。

本试验也用峰面积作过标曲，R2=0.95；而用峰高作标曲时，R2=0.98,线性更好一些。所以后来的试验用的是有关峰高的标准曲线。
另外，即使用峰面积的标曲计算，还是得到同样的结果。
请各位大侠指教。
‘

根据峰高，而做的标准曲线


标准品的HPLC峰图


待测样品X的HPLC峰图
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lijin79833313
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2010/8/12 11:43:18 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
首先这位战友的计算好像是有点问题：根据线性公式10ul的进样量的峰高应为922.5,10ul的进样量相当于5ug样品，因此，兄弟实测峰高为1280.1，计算出的样品量应该为1280.1/922.5*5=6.94ug。所以，你算的32ug不知道你怎么算的。
其次，兄弟做线性的方法个人觉得不是很准确，一般的做法为峰面积或峰高对样品的浓度进行线性回归，你应该配制不同浓度的样品，统一进样量然后做线性。因为你用微量注射器定量本身就不准确。
最后，你的色谱条件也不是很好，应该先看下重复性是否能够满足要求。
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xue2009
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2010/8/12 13:58:32 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
对，为什么不配置不同浓度的标样进同样的体积？还有就是你这个线性实在不好，估计这个也对你结果造成了较大的影响，重做吧，你这个方法既不简洁又不准确。
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lwjxzj
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2010/8/12 14:01:19 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
以下是做标曲的原始数据
5        721.2
7.5        861.3
10        945.4
12.5        1011.8
15        1090.7
25        1373.9



HPLC整个过程采用梯度洗脱，条件是:
time(min)                    乙腈（%）      0.05%三氟乙酸（%）
0                                        10                                    90
8                                        18                                    82
8.1                                      100                                0
12                                      100                                0
15                                        10                                  90

210nm检测
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2010/8/12 14:35:39 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
是3min的那个很高的峰

请问如何让出峰时间延迟呢？

请问什么叫“样品好像在死体积附近”，我应该怎么改进方法呢？
“改善分离条件，如使用离子对是试剂 ...”请问什么是“离子对是试剂”呢？

标准曲线的横坐标是表示A物质的质量，我的计算过程是
（1280.1-609.64）/31.286=21ug
刚才，把一楼的结果写错了，已经改过来了，呵呵
不过还是21ug〉5ug，请大家再帮我想想这是为什么呢？
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2010/8/12 14:37:14 Last edit by lwjxzj
有水有渝
xky0230699
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2010/8/12 20:26:42 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主做的是什么，该物质都有哪些理化性质，这些信息不知道，很难选择色谱条件。
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lsj_260813992
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2010/8/12 21:03:20 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你的标准曲线的设计我在实验室时接触过这种做法，但是结果是出现了无法解释的数据，所以直接放弃了。建议你还是配置成不同的浓度，然后进相同体积后，在进行标准曲线制作。最好先做个最低检测限，在进行标准曲线的制作。
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