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主题：【求助】请教：液相 检测出现问题！

浏览0 回复8 电梯直达
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发表于：2010/08/12 11:20:43 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第一次用HPLC定量,得出无法解释的结果,请各位大侠帮忙.

用A物质标准品(固体粉末),ddw制成0.5mg/ml溶液，分别进样5ul，10ul，15ul，20ul，25ul，30ul，50ul进行HPLC，根据标准品HPLC检测时的峰高，制得峰高与进样量关系的标准曲线y=31.286x+609.64(R2=0.98)。

将待测样品X（固体粉末），ddw制成0.5mg/ml溶液，进样10ul（质量为5ug），HPLC检测，A物质的峰高为1280.1，根据标准曲线的计算得HPCL检测的10ul X样品中A物质的含量为32ug,可是X物质进行HPLC检测时，进样总质量不过5ug,A物质在其中的含量怎么可能为32ug（〉5ug）呢？

目前，我能够想到的原因：

1，样品配置的时候出现了问题：
但是，A和X物质同时进行称量、配制，都是取20mg样品，溶于200ul ddw，配成100mg/ml母液，然后取5ul母液ddw稀释至1ml,配成0.5mg/ml的检测溶液。如果配制过程有问题，那么两种物质的溶液浓度就会都有问题，不会两者之间有这么大的差异。

2，X样品在A吸收峰的地方，还有另外一种物质的吸收峰：
但是，HPLC的条件（流动相中有机相和无机相的配比）做过多次改动，X物质中A物质出峰时间与A物质标准品的出峰时间总是一致的，没有看见X物质的A峰周围有其它峰出现；并且，X物质的A峰，很犀利，不像夹杂有其它物质。

不知道还有什么问题，我忽略掉了，没有注意，请各位大侠指点。

本试验也用峰面积作过标曲，R2=0.95；而用峰高作标曲时，R2=0.98,线性更好一些。所以后来的试验用的是有关峰高的标准曲线。
另外，即使用峰面积的标曲计算，还是得到同样的结果。
请各位大侠指教。

根据峰高，而做的标准曲线


标准品的HPLC峰图


待测样品X的HPLC峰图
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2010/8/12 12:14:47 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
基线走的很不稳啊，是13.8min左右的峰吗？
你计算时的稀释倍数搞清楚了没？
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2010/8/12 14:01:09 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
以下是做标曲的原始数据
5        721.2
7.5        861.3
10        945.4
12.5        1011.8
15        1090.7
25        1373.9



HPLC整个过程采用梯度洗脱，条件是:
time(min)                    乙腈（%）      0.05%三氟乙酸（%）
0                                        10                                    90
8                                        18                                    82
8.1                                      100                                0
12                                      100                                0
15                                        10                                  90

210nm检测
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2010/8/12 14:35:29 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
是3min的那个很高的峰

请问如何让出峰时间延迟呢？

请问什么叫“样品好像在死体积附近”，我应该怎么改进方法呢？
“改善分离条件，如使用离子对是试剂 ...”请问什么是“离子对是试剂”呢？

标准曲线的横坐标是表示A物质的质量，我的计算过程是
（1280.1-609.64）/31.286=21ug
刚才，把一楼的结果写错了，已经改过来了，呵呵
不过还是21ug〉5ug，请大家再帮我想想这是为什么呢？
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2010/8/12 14:37:03 Last edit by lwjxzj
xiaohe147
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2010/8/17 22:17:15 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.感觉好像是浓度配制错了。如果对照品和样品一起配错了，标准曲线的横坐标就是错的，结果肯定有问题。
2.A在柱子上没什么保留，在死体积出峰。可以尝试将梯度起始时间的水相调整为0，从100%的水相开始变化，A峰的保留时间应该会增加。
该帖子作者被版主 cxm2009加 5积分， 2经验，加分理由：鼓励讨论
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jm0311
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2011/1/12 12:03:33 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我觉得问题出在你的目标峰出在死时间附近的，线性是很不好的，R2=0.98就说明这个问题，赞成4楼的意见，调流动相，如果可以的话换根长点的柱子。降低柱温，还有的话进针溶剂扣下空白，再做曲线看看。还是推荐采用峰面积作曲线。
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lunanjituan
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2011/1/20 22:46:48 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一、你的标准品含量100%的吗？
二、按照你的峰高看是在结果20μg左右的，这个应该不会错
三、用外标法以峰面积计算可以吗？
四、配样为什么不一次配好？还移液一次就不是很精确了，25mg到50ml不可以吗？
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yankunsu
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2011/1/27 16:45:33 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
进样量不对，配置标准品时，应配置不同浓度而进样量相同。如果定量环是20ul你进25ul、30、50都是20ul而且5ul、10ul、15ul、20ul在进样中并不成比例
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jinp590313
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2011/1/30 16:03:10 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
同意7楼观点，标准曲线是错的。应配制梯度浓度，进样量在50ul为好。
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