主题：【原创】色谱方法建立岂无凭？——浅谈HPLC方法的建立

原文由 laina0319(laina0319) 发表:
有用，谢谢楼主，我有个问题想请教一下，我在用超高效液质分析多环芳烃，但是灵敏度不高，有没有什么方法改善，比如说在流动相中添加某写些物质，或者使用一些缓冲液。还有，我用的流动相是甲醇水，初始梯度80%，我的样品溶剂甲醇水1:1，效果是不是最好的？我接触色谱的时间不长，有什么说错的地方还请大家海涵。

原文由 小丑(joker) 发表:

原文由 wdl158160(wdl158160) 发表:
请教一个问题：为什么样品溶剂的洗脱强度明显高于流动相洗脱强度会造成色谱峰分叉？

答：进样后，样品溶液与流动相接触，如果二者的溶剂不一致，会出现下列两种情况：
其一，样品溶剂与流动相间存在浓度差，这个浓度差指的是溶剂浓度差(比如流动相中有机相浓度较低，样品溶剂有机相较高)，此时样品溶剂扩散速度快，造成样品峰展宽；不论进样体积大还是小，只要流动相溶剂与样品溶剂不一致，基本都会发生这种不必要的展宽，但不一定会分叉；
其二，样品溶液溶剂与流动相组成差别较大时，样品溶液与流动相的混合不能瞬间完成，就会导致“球状”样品溶液由核心到边缘存在浓度差，核心有机相浓度高，向边缘逐渐降低。进入色谱柱后，边缘部分样品分子随流动相正常移动，而核心分子因溶剂氛围有机相较高，在色谱柱中移动较快，反映在色谱图上就是前延，甚至前分叉。减小进样体积，柱前可以充分混合，可以消除分叉。

原文由 laina0319(laina0319) 发表:
有用，谢谢楼主，我有个问题想请教一下，我在用超高效液质分析多环芳烃，但是灵敏度不高，有没有什么方法改善，比如说在流动相中添加某写些物质，或者使用一些缓冲液。还有，我用的流动相是甲醇水，初始梯度80%，我的样品溶剂甲醇水1:1，效果是不是最好的？我接触色谱的时间不长，有什么说错的地方还请大家海涵。

原文由 小丑(joker) 发表:

原文由 geebzbz(geebzbz) 发表:
顶！楼主写的很好，也提供了一个很好的交流机会。谢谢了！
我问大家一个简单的问题哈：我目前正在分离细菌发酵产物中的活性物质，用Agilent1200，对于样品的检测波长我怎么确定啊？样品来源是乙酸乙酯萃取后，用水溶解，这个水溶液也做过紫外扫描，可是在190到300这段里边很多很强的吸收峰；如果稀释的话，随着稀释倍数的增加，峰个数不断减少，峰对应的最大波长也不断地蓝移，这样的情况下，我该怎样去确定一个或者几个波长检测的波长呢？因为DAD可同时检测5个波长。谢谢指导了！

严格来说，您分析的样品应为发酵产物乙酸乙酯萃取物，样品中化合物的种类复杂并且有待于定性。此时，本人建议您这样做：二极管阵列检测，采集数据后，在230 nm-400 nm波长范围内，每隔10 nm提取一张色谱图；如果样品溶液有颜色，应在230 nm-800 nm范围内每隔10 nm提取一张色谱图。“DAD同时检测5个波长”，这是采集数据的情况下可同时监测5个波长，实际上在数据后处理部分，您想要哪个波长下的色谱图都可以。还需要在熟悉一下仪器操作啊。

原文由 Eda(diamonsil-girl) 发表:

原文由 xue2009(xue2009) 发表:

原文由 小丑(joker) 发表:

原文由 geebzbz(geebzbz) 发表:
顶！楼主写的很好，也提供了一个很好的交流机会。谢谢了！
我问大家一个简单的问题哈：我目前正在分离细菌发酵产物中的活性物质，用Agilent1200，对于样品的检测波长我怎么确定啊？样品来源是乙酸乙酯萃取后，用水溶解，这个水溶液也做过紫外扫描，可是在190到300这段里边很多很强的吸收峰；如果稀释的话，随着稀释倍数的增加，峰个数不断减少，峰对应的最大波长也不断地蓝移，这样的情况下，我该怎样去确定一个或者几个波长检测的波长呢？因为DAD可同时检测5个波长。谢谢指导了！

严格来说，您分析的样品应为发酵产物乙酸乙酯萃取物，样品中化合物的种类复杂并且有待于定性。此时，本人建议您这样做：二极管阵列检测，采集数据后，在230 nm-400 nm波长范围内，每隔10 nm提取一张色谱图；如果样品溶液有颜色，应在230 nm-800 nm范围内每隔10 nm提取一张色谱图。“DAD同时检测5个波长”，这是采集数据的情况下可同时监测5个波长，实际上在数据后处理部分，您想要哪个波长下的色谱图都可以。还需要在熟悉一下仪器操作啊。

"每隔10 nm提取一张色谱图",是什么意思？说实话我也不懂，期待解释。谢谢

HPLC-DAD检测器分析后，获得的是以保留时间为X轴、以响应值为Y轴、以波长为Z轴的三维色谱、光谱图，数据中，分析者可以在三维图上找出任一波长(波长应处于采集数据时的波长范围)的色谱图。用了DAD后您就明白多了。