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紫外可见分光光度计（UV）
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主题：【资料】朗伯-比尔定律的偏离及理论解释

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初学者&九点虎
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发表于：2010/11/20 19:47:45 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
郎伯-比尔定律为UV-Vis定量的基本公式，适用的前提是：1.入射光为单色平行光，2.吸收发生在均匀介质中，3.吸收物质及溶剂互不作用。干扰因素包括：杂散光或复合光引起的负偏移，非平行光引起的正偏移，化学因素引起的偏移等。另外该定律推导时未考虑反射分数的影响，因此在浓溶液及混浊液中也有偏离。

杂散光引起的误差：杂散光对吸光度的测定引起负偏移，且在吸光度愈大时愈明显。另外，对仪器输出的边缘波长来说 ,单色器的透射率、光源光强和接收器的灵敏度都是比较低的 ,这时杂散光影响就更为明显 ,所以在紫外分光光度计中 ,首先应该检查 200～220 nm处的杂散光。由于杂散光强度在边缘波段较大 ,因此在波长小于 220 nm进行紫外分光光度 ,测定时 ,常出现一种假峰 ,其原因 ,主要是样品随波长变短而吸收增大 ,可是由于杂散光在短波时急剧增大 ,因而使原来逐渐增大的吸收反而变小 ,就会出现不应有的“假峰”。

杂散光产生的原因：杂散光有两种 ,一种是杂散光的波长与测量波长相同,它是由于测量波长因种种原因偏离正常光路 ,在不通过样品的情况下,就直接射到光电接收器上。引起这种杂光的原因是由于光学、机械零件包括样品本身的反射和散射所引起。这种杂散光可以通过一个对测定波长不透明的样品来检查。当发现放在试样池中的不透明样品的透光率不为零时 ,说明仪器中有上述杂光存在。但当光度存在零位误差时 ,可能令造成混淆 ,如果在不透明的样品上涂上白色 ,则可增强样品本身反射和散射的效果 ,以提高测量灵敏度。
第二种杂散光是由光学系统中的缺陷所引起 ,如不必要的反射面、光束孔径不匹配、灰尘的散射、光学表面的擦痕、光学系统的象差、不均匀色散等都会降低光线的单色性 ,使杂光增加。仪器光源系统设计不良、机械零部件加工不良、位置错移、仪器内壁防眩黑漆脱落等等也是造成杂散光的原因。通常所指的杂散光是上述的第二种。

使用过程中减小杂散光的方法：(1 )因光学零件表面沾污、积尘而使杂散光增大 ,则可用清洁的软毛刷或吹气球除去积尘 ,或经脱脂的软布和纯净的溶剂 (如乙醚 :酒精 =2 :1的混合液 ) ,小心地擦试光学零件 (不包括反光镜 )表面。
(2 )如果是由于光学零部件 (如棱镜、通光窗口等 )表面潮解发毛 ,或由于反射镜面失泽甚至膜层破坏而使杂散光增大 ,则必须重新抛光或重新镀膜或者更换光学零件。
(3 )如果光学零件受震后松动、移位、光束不能准确行进 (偏离正常光路光束被切割或射到非工作表面等 )。则必须仔细调节光源和反射镜 ,使它们重新回到正常工作位置。
为了防止仪器杂散光增大 ,在日常工作中应经常注意保护仪器 ,特别是防尘和防潮 ,防沾染 ,所以不要轻易打开单色器和光度计部分的封盖板 ,不能用手直接触摸光学零件表面。

吸收定律是一个有限的定律
最近看到一个帖子，问吸光度指标在多少范围好？简单地说，吸光度A在0.2—1.4范围内和浓度C之间的线性关系较好。浓度越高误差越大。原因是多方面的。
1.        吸收定律基本性质的限制
A＝abC 这是朗伯—比耳定律。其中比耳定律部分表示吸光度(A)和浓度(C)之间呈线性关系。但这只适用于稀溶液时才成立。在高浓度时吸收成分之间的平均距离缩小，临近质点间电荷分布互相受到影响，同时改变了他们对特定辐射的吸收能力。此现象使得A—C的线性关系发生偏差。浓度越高，偏差越大。
此外，定律的偏差还与溶液的折射率有关。溶液的吸光系数a和折射率有一定的函数关系，而折射率是随浓度变化的。这是偏差造成的另一原因。
当然，采用适当的方式仍可在高浓度时进行定量分析，如差示光度法等。
2.        实际条件的偏离
吸收定律有四个隐含的假设。1），光和被测成分之间的相互作用只是光被成分吸收。2），采用“单色光”。3），吸收成分相互无关，而不论数量和种类。4），吸光要限于同样的光程和横断面。实际情况并不是这样，四个假设均会出现偏差。
1).荧光，磷光和散射都会引起不同程度的“非真”吸收。荧光，磷光可以加适当的滤光片滤除。而散射的问题就比较复杂，不容忽视。
2).所有的单色器均不能输出真正的单色光，只是宽窄不同。所以对吸收的影响也不同。此外，不同的物质其吸收峰宽度是不同的。因此仪器的光谱带宽亦成为分析工作者十分重视的一项指标。
3).不同组分的物质同时出现在被测溶液中的情况是十分普遍的。当浓度增大时往往产生某些附加效应，如凝聚，聚合，水解等，从而影响物质的吸光效应。
4).光程的不一致性是引起吸光度偏差的另一原因。多数仪器通过样品池的光是不平行的。而为了得到足够光强，光束必须有一定孔径角。计算证明，入射孔径角为10度时，即会产生0.3%的吸收误差。此外，池壁的平行度，光洁度，光的内反射，干涉等都可能引起不同程度的吸光度偏离。
3.测试过程中产生误差
采用分光光度法进行定量分析的过程中，均可能产生化学的误差，仪器的误差以及人为的误差。有经验的分析工作者都会采取相应的措施，以减少这些误差。这里不再过多的累述。

总之，光度法测量样品浓度会随浓度的增大而出现线性偏差，绝大多数是向下偏离。因此采用一组标准浓度溶液作出二次标准曲线，以此标准曲线对照测出样品浓度的方法，即可较好地减少测量偏差。
该帖子作者被版主 鸿雁加 10积分， 2经验，加分理由：周六还加班，二虎辛苦了
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2010/11/20 20:21:35 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一直想了解而没了解的现在明白了！
终于知道做原吸时为什么在高浓度时曲线偏移的原因了！
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初学者&九点虎
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2010/11/20 20:56:49 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 wdl158160(wdl158160) 发表:
一直想了解而没了解的现在明白了！
终于知道做原吸时为什么在高浓度时曲线偏移的原因了！

是的，原吸和紫外定量理论基础都是比尔定律
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青林
wyqql2060
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2010/11/20 21:30:23 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
很基础的知识,重新温习了!
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tutm
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2010/11/20 21:40:44 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
资料分析很全面了。
对于单色光问题，不知以后会不会出现激光为光源的分光光度计。激光在拉曼、共聚焦显微成像方面应用已经很成熟了，只是可调波长还受限制。
该帖子作者被版主 3859085加 5积分， 2经验，加分理由：tutm老师看的远，有远见
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ghcily
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2010/11/20 22:14:39 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 初学者&九点虎(zhouyuhu) 发表:
原文由 wdl158160(wdl158160) 发表:
一直想了解而没了解的现在明白了！
终于知道做原吸时为什么在高浓度时曲线偏移的原因了！

是的，原吸和紫外定量理论基础都是比尔定律


光谱仪器的基础都是
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鸿雁
3859085
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2010/11/21 8:01:01 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我从头到尾学习了一遍，并且把明显的主题句用颜色字体标出来了，二虎不介意吧
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tutm
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2010/11/21 11:08:56 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
受鸿雁版主鼓励，再谈几句。

文中“吸光度A在0.2—1.4范围内和浓度C之间的线性关系较好。浓度越高误差越大。原因是多方面的”

这两句话中的前一句“吸光度A在0.2—1.4范围内和浓度C之间的线性关系较好”，强调一下，这只是针对仪器说的，与溶液浓度并不直接相关。
比如，我们测一种染料溶液，使用最普遍的10mm比色皿在Unico2100上，当浓度为0.01%时，最大吸收波长下的吸光度就达到了1.8+，测试时Abs 1.5左右就数据跳动、读数困难，应该是透光率太低，仪器噪声已严重影响测试了；换台仪器，使用TU1901，则数据相对稳定得多，还能测试，但曲线线性不太好了。然而，我们换用1mm光径的比色皿，测到0.05%+浓度，两台仪器的线性都很好。
这个例子想说明的是：使用普通10mm比色皿，吸光度太高不能测时，只要溶液浓度并不是很高（比如说1%以上），先不要以为是溶液浓度高造成的。可以用光径小些的比色皿试试，也许会省却你稀释溶液的麻烦，也可能会减少稀释带来的误差。

由此，建议各位订购分光光度计时，特别是用于科研或产品研发的，测试溶液浓度不定的情况下，选购几套不同光径的比色皿，可能对你们的工作会带来意想不到的便利。呵呵，这可不是做广告。
该帖子作者被版主 xiaoanxiaoye加 2积分， 2经验，加分理由：感谢tutm
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hongwei-tlm
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2010/11/21 12:32:03 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原吸时在高浓度可换次灵敏波长，怎么解释
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huacai
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2010/11/21 13:15:01 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
是呵，次灵敏波长也应存在杂散光
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祥子
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2010/11/21 13:51:52 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 hongwei-tlm(hongwei-tlm) 发表:
原吸时在高浓度可换次灵敏波长，怎么解释


这个是不是在理解上有偏差呢？

一般都是说测的吸光度值过大时，可以选择次灵敏线吧？

如果是因为样品浓度过大，样品分子之间发生相互作用引起的曲线弯曲，那换成次灵敏线八成也不行。

再者，吸光度过大，说明透过的光过少，那杂散光的影响就比较显著了，也会造成曲线弯曲。

如果换成次灵敏线，吸收的变少，透过的光变多，杂散光的影响就会变小。

这个其实跟换不同光程的比色皿一样道理。

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