主题：【第三届原创参赛】HPLC法测定盐酸舍曲林片的有关物质

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HPLC法测定盐酸舍曲林片的有关物质

摘要：目的：建立盐酸舍曲林片有关物质的测定方法，其外标法测定其四种光学异构体，自身对照法测定其它有关杂质。方法：采用依利特Hypersil ODS2色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相为磷酸二氢钠缓冲液［取磷酸二氢钠12.5g, β-环糊精12.8g，HP-β-环糊精17.3g,加水至1000ml］-乙腈-三乙胺（800：200：10）,用磷酸调节p H 为2.5±0.5为流动相，流速为每分钟1ml/min，检测波长为214nm。结果：建立了β-环糊精、HP-β-环糊精手性流动相拆分盐酸舍曲林光学异构体,的方法，结论：该方法专属性好，无干扰，盐酸舍曲林异构体与主峰分离良好。可作为控制盐酸舍曲林片质量的方法。

关键词：HPLC外标法；HPLC自身对照法；盐酸舍曲林片;光学异构体; β-环糊精; HP-β-环糊精。

盐酸舍曲林是一种选择性抑制5-羟色胺再摄取的抗抑郁药（SSRI），为新一代抗抑郁药的代表药物，目前已跃成为抗抑郁治疗的一线药和首选药。盐酸舍曲林由美国辉瑞公司开发，并于1990年12月最初在英国上市，目前为止已经在30个国家陆续上市。盐酸舍曲林（商品名：郁尔复片剂）于1996年12月获得中国药品行政保护，并于当年在中国以片剂形式（不含原料药）上市，用于治疗精神抑郁症。现在国内各大医院、药店均有销售。盐酸舍曲林在中国无专利保护。2004年6月该行政保护终止。

由于盐酸舍曲林存在4种光学异构体，在合成工艺过程中可能会引入中间杂质盐酸舍曲林顺式左旋异构体，盐酸舍曲林反式左旋异构体，反式右旋异构体，因其均为手性异构体，眼前其异构体检测方法为毛细管电泳法，且只对其异构体顺式左旋异构体进行检测，其它杂质检测采用反相HPLC，且其盐酸舍曲林主峰不能很好的与其相邻异构体分开，参照相关文献，并经方法学研究，建立了盐酸舍曲林有关物质的检测方法，采用HPLC外标法测定盐酸舍曲林光学异构体，并采用已确定的检测条件进行对盐酸舍曲林光学异构进行了定位，确定了盐酸舍曲林异构体与主峰分离良好。同时我们采用HPLC自身对照法测定其它的有关物质。经最低检测限、专属性、线性、精密度等方法学研究，表明采用该HPLC方法测定本品有关物质专属性强，无干扰，结果准确。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（日本岛津，LC-10AVP/SPD-10Avp），浙大2010色谱工作站

色谱柱（伊利特，C18，4.6μm×150mm）

乙腈（色谱纯）、磷酸二氢钠（A.R.）、β-环糊精（A.R.）、HP-β-环糊精（A.R.）

三乙胺（A.R.）

盐酸舍曲林片：批号：090301、090302、090303（自制）; 规格：50mg

批号：0812302（浙江新东港药业股份有限公司）规格：50mg

盐酸舍曲林对照品：(批号：20070403M；含量：99.6%)，盐酸舍曲林（1R4S）异构体对照品：（批号：20060401；含量：99.2%），盐酸舍曲林（1S4R）异构体对照品：(批号：20060401；含量：98.6%)，盐酸舍曲林（1R4R）异构体对照品：(批号：20060401；含量：99.8%)，上述对照品均由浙江新东港药业股份有限公司提供。

2方法与结果

2.1色谱条件及拟定测定方法

照高效液相色谱法(中国药典2005版二部附录VD)测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钠缓冲液［取磷酸二氢钠12.5g, β-环糊精12.8g，HP-β-环糊精17.3g,加水至1000ml］-乙腈-三乙胺（800：200：10）,用磷酸调节p H 为2.5±0.5为流动相，检测波长为214nm,流速为每分钟1.0ml。盐酸舍曲林峰与盐酸舍曲林异构体峰的分离度不得小于1.5,理论板数按盐酸舍曲林峰计算应不低于2000。

取本品10片，研细，精密称取适量，用流动相溶解并制成每1ml中含盐酸舍曲林1mg的溶液,摇匀,滤过，作为供试品溶液；精密量取上述供试液1.0ml置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。另取盐酸舍曲林顺式左旋构体,反式左旋异构体,反式右旋异构体对照品适量，加流动相溶解并制成每1ml中含盐酸舍曲林顺式左旋构体10ug，反式左旋异构体、反式右旋异构体各5ug的溶液，作为对照品溶液（1）。取对照品溶液（1）20μl，注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分峰高约为满量程的20％，再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，盐酸舍曲林异构体按外标法以峰面积计算，供试品中含盐酸舍曲林顺式左旋构体的量不得过1.0%，含反式左旋异构体、反式右旋异构体的量均不得过0.5%；量取除异构体外的其它杂质峰面积之和，不得大于对照溶液主峰面积（1.0％）。

2.2溶液的配制

供试品溶液：取本品10片，研细，精密称取约0.35g（相当于盐酸舍曲林10mg），置100ml的量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,滤过，作为供试品溶液。

对照溶液：精密量取上述供试品溶液1.0ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。

盐酸舍曲林光学异构体对照品溶液：取盐酸舍曲林顺式左旋构体,反式左旋异构体,反式右旋异构体对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中含盐酸舍曲林顺式左旋构体10ug,反式左旋异构体,反式右旋异构体各5ug的溶液。

空白辅料溶液：按处方比例称取本品辅料混粉适量，照供试品溶液配制方法配制溶液。

2.3色谱条件的筛选、优化

参照盐酸舍曲林质量标准[YBH24572005] [1]有关物质项下的色谱条件，以十用烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸缓冲液［取磷酸10ml, 三乙胺3ml,加水至1000ml］-甲醇-乙腈（40：60：10）,检测波长220nm。在该色谱条件下时盐酸舍曲林四个光学异构体彼此相互重叠，得不到分离；参照文献陈德英、陈玉英等“HP-β-环糊精对盐酸舍曲林异构体手性选择包合和色谱保留行为影响的研究” [4]文献，以十用烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸钠缓冲液［含0.17mol/L磷酸钠、10.5mmol/LHP-β-环糊精］ -乙腈（68：32）,检测波长225nm, 在该色谱条件下时盐酸舍曲林光学异构体1R4S与1S4R两异构体完全重叠,其它异构体之间能得到很好的分离。

通过对上述色谱条件的摸索可知流动相体系含有HP-β-环糊精时可使盐酸舍曲林光学异构体1S4S、1R4R与1R4S和1S4R得到分离，因些在参照文献孙山、黄信“HPLC法测定盐酸舍曲林有关物质研究” [3]文献色谱条件，以十用烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸二氢钠缓冲液［含0.02mol/L磷酸二氢钠、10mmol/LHP-β-环糊精、10mmol/Lβ-环糊精］ -乙腈（80：20）,检测波长214nm，流速1.5ml/min。在刻色谱条件下时盐酸舍曲林四个光学异构体之间能得到很好的分离，但供试液主峰峰形宽大，且各峰保留时间较长，流速较大，造成柱压过高。

因此，在上述色谱条件的基础上，对色谱条件进行优化，磷酸二氢钠浓度为80mmol/L, 磷酸二氢钠浓度的增加，增加了HP-β-环糊精及β-环糊精的溶解度，稳定了药物所形成的包合物，加入了三乙胺（含量1%）减轻和消除了峰拖尾现象，同时稍增加了HP-β-环糊精（11mmol/L）及β-环糊精（11mmol/L）的浓度，使保留时间得到提前，因 HP-β-环糊精及β-环糊精对顺式及反式异构体识别能力的强弱不一致，兼顾分离度和色谱峰形，选择流速为1.0mol/L。

2.4 系统适用性试验

精密称取盐酸舍曲林工作对照品约10mg,置于10ml量瓶中，加入少量流动相溶解，使制成每1ml中含盐酸舍曲林顺式左旋构体10ug,反式左旋异构体,反式右旋异构体各5ug的溶液，加流动相稀释至刻度，摇匀；作为系统适用性溶液。在上述色谱条件下，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果盐酸舍曲林峰的理论板数为4562.6，盐酸舍曲林峰与盐酸舍曲林光学异构体峰的分离度为3.56。见附图1。

试验结果表明，该色谱条件系统适用性试验好，能满足中国药典规定的试验要求。

2.5干扰试验

取上述空白辅料溶液，在上述色谱条件下，取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。结果在保留时间为2.0分钟的位置处有一小峰出现，但在盐酸舍曲林主峰位置处未见有吸收峰，故辅料对有关物质测定不存在干扰，考虑到辅料峰峰高积分值很小，可忽略不计，表明在计算本品有关物质时可不扣除辅料峰。见图2。

2.6溶剂空白试验

取溶剂20ul注入液相色谱仪, 结果见有关物质图谱。

从图谱上可以看出,试验所用的溶剂没有吸收峰，所以对盐酸舍曲林有关物质的测定没有干扰。见图3。

图1 系统适用性图谱

图2空白辅料图谱

图3空白溶剂图谱

2.7供试品溶液浓度确定

根据本厂仪器的灵敏度，选择分离度合适的供试品溶液浓度，因此我们进行了杂质检出个数的比较。

从试验结果可看出，盐酸舍曲林浓度分别3mg/ml、2mg/ml、1mg/ml时，杂质峰检出个数一致，浓度为3mg/ml时峰形较肥大，分离度较差；浓度为1mg/ml时盐酸舍曲林主峰峰形较好，理论板数及分离度均符合试验要求。

2.8专属性试验

（1）强酸破坏试验

取供试品（090301批）细粉约0.35g，加入6 mol/l盐酸溶液5ml，室温放置15小时后，用6 mol/l氢氧化钠溶液中和，再用流动相稀释至100ml,摇匀,滤过,取20μl进样测定，记录色谱图。结果盐酸舍曲林峰与各杂质峰分离度为2.553。见图4。

（2）强碱破坏试验

取供试品细粉约0.35g，加入6mol/l氢氧化钠溶液5ml，室温放置10小时后，用6 mol/l盐酸溶液中和，再加流动相稀释至100ml，摇匀,滤过,取20μl进样测定，记录色谱图。结果盐酸舍曲林峰与各杂质峰分离度为2.663。见图5。

（3）热破坏试验

取供试品细粉约0.35g，加少量流动相溶解后，置于100℃水浴中加热8小时，放冷后，再加流动相稀释至100ml，摇匀,滤过,取20μ进样测定，记录色谱图。结果来盐酸舍曲林峰与各杂质峰分离度为2.856。见图6。

（4）氧化破坏试验

取供试品细粉约0.35g，加入5%H2O2溶液5ml，室温放置15小时后，加流动相稀释至100ml，摇匀,滤过,取20μl进样测定，记录色谱图。结果盐酸舍曲林峰与各杂质峰分离度为2.993。见图7。

通过上述剧烈条件破坏试验，结果表明建立的HPLC条件能分离破坏的主要产物。

图4 强酸破坏性图谱

图5 强碱破坏性图谱

图6 加热破坏性图谱

图7 氧化破坏性图谱

图8 供试液图谱

2.9有关物质进样精密度试验

分别精密称取盐酸舍曲林四光学异构体工作对照品、加流动相溶解并稀释制成每1ml中含盐酸舍曲林10ug,盐酸舍曲林顺式左旋构体10ug,反式左旋异构体,反式右旋异构体各5ug的混合溶液,取上述混合对照溶液20μl注入液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图。结果见表1。

表1 盐酸舍曲林有关物质进样精密度试验结果

试验结果表明，该方法仪器进样精密度良好。

2.10有关物质定位

分别精密称取盐酸舍曲林四光学异构体工作对照品、分别加流动相溶解并稀释制成每1ml中含盐酸舍曲林10ug，盐酸舍曲林顺式左旋构体10ug，反式左旋异构体、反式右旋异构体各5ug的溶液,取上述各对照溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。保留时间见下表2。

表2 盐酸舍曲林四光学异构体定位

序号	（1R4S）峰面积	（1S4R）峰面积	（1S4S）峰面积	（1R4R）峰面积
保留时间	22.929	26.261	31.960	36.052

2.11有关物质线性试验

分别精密称取盐酸舍曲林四个光学异构体工作对照品、分别加流动相溶解并稀释制成每1ml中含盐酸舍曲林100ug，盐酸舍曲林顺式左旋构体100ug，反式左旋异构体、反式右旋异构体各50ug的混合贮备溶液,分别精密量取上述对照品贮备液0.1ml、0.4ml、0.6ml 、0.8ml、1.0ml 、1.2ml、1.4ml置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，取20μl分别注入液相色谱仪,记录色谱图。以进样量(ug)为横坐标，峰面积为纵坐标求得回归方程。结果见表3。

表3 盐酸舍曲林有关物质线性试验结果

试验结果表明，该方法在盐酸舍曲林、盐酸舍曲林顺式左旋构体进样量为 0.01～0.15ug范围内，峰面积与其进样量呈良好线性关系；盐酸舍曲林反式左旋异构体，反式右旋异构体进样量为 0.02～0.30ug范围内, 峰面积与其进样量呈良好线性关系。

2.12盐酸舍曲林四个光学异构体定量限

取盐酸舍曲林光学异构体（1R4S）对照品用流动相配制成一定浓度，再逐级递减稀释成含1R4S分别为 0.1ug/ml、0.3ug/ml 的溶液，分别精密吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。经测定，1R4S定量限（按信噪比约10：1计）为6ng，且其结果具一定精密度。见表4。

取盐酸舍曲林光学异构体（1S4R）对照品用流动相配制成一定浓度，再逐级递减稀释成含1S4R分别为 0.08ug/ml、0.24ug/ml 的溶液，分别精密吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。经测定，1S4R定量限（按信噪比约10：1计）为4.8ng，且其结果具一定精密度。见表4。

取盐酸舍曲林光学异构体（1S4S）对照品用流动相配制成一定浓度，再逐级递减稀释成含1S4S 分别为0.11ug/ml、0.22ug/ml 、0.33ug/ml的溶液，分别精密吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。经测定，1S4S定量限（按信噪比约10：1计）为4.4ng，且其结果具一定精密度。见表4。

取盐酸舍曲林光学异构体（1R4R）对照品用流动相配制成一定浓度，再逐级递减稀释成含1R4R 分别为0.1ug/ml、0.3ug/ml 的溶液，分别精密吸取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。经测定，1R4R定量限（按信噪比约10：1计）为6ng，且其结果具一定精密度。见表4。

见表4 盐酸舍曲林四个光学异构体定量限（精密度试验）结果

试验结果表明：该方法盐酸舍曲林四个光学异构体定量限进样精密度试验良好。

2.13供试液溶液稳定性试验

将配制好的供试液，室温放置，分别于第0、2、4、6、8小时取20μl测定，结果见表5。

表5 有关物质测定供试液稳定性试验结果

进样时间（hr）	0	2	4	6	8	平均值	RSD（%）
总杂质峰面积	572635.7	592497.9	591509.8	58932.1	577406.2	584674.1	1.6

试验结果表明，该方法本品供试液在室温条件下比较稳定。

2.14样品有关物质测定的结果

取本品，照上述拟定的方法测定。三批自制样品及上市样品测定结果见表6。

我们采用了外标法测定盐酸舍曲林的三个光学异构体，同时采用了面积自身对照法法计算供试品中其它的有关物质。见表6

表6 供试品有关物质测定结果

批号	外标法（%）			自身对照法（%）
批号	1R4S含量	1S4R含量	1R4R含量	其它杂质含量
090301	0.031	0.11	0.26	0.16
090302	0.031	0.11	0.26	0.16
090303	0.040	0.12	0.24	0.18
市售	0.046	0.16	0.29	0.40

试验结果表明，三批自制样品结果及上市样品均符合规定。

3讨论

综上所述，通过上述方法学验证，结果显示所选方法适合于本品有关物质的检测要求。由于盐酸舍曲林存在4种光学异构体，眼前其异构体检测方法为毛细管电泳法和手性柱进行折分，其价格昂贵，手性柱不容维护、通用性差，而采用常规的反相色谱法，其四个光学异构体彼此相互重叠，得不到分离；没法控制本品的质量。采用反相色谱法，在流动相系统中加入HP-β-环糊精及β-环糊精可以在同一色谱条件中拆分四种光学异构体，使其操作简便、快速、分离效果好，比较经济，较之手性固定相法和毛细管电泳法普及，且采用同一色谱条件进行其异构体和其它杂质的检测、使操作简便，不费时。但由于其流动相系统酸性较强， HP-β-环糊精及β-环糊精容易造成柱子堵塞，柱压升高，色谱柱容易损伤，因些试验结束后需花较长时间清洗色谱柱。建议在选择色谱柱时可选择一些耐酸性较强的色谱柱。

4.参考文献：

[1] 盐酸舍曲林质量标准 [YBH24572005]. 国家药品标准

[2] 盐酸舍曲林片质量标准 [WS1-（X-452）-2003Z]. 国家药品标准新药转正标准第47册

[3] 孙山,黄信. HPLC法测定盐酸舍曲林有关物质研究. 四川医学.2005,7；26 （ 7）:761～762.

[4] 陈德英，陈玉英等.HP-β-环糊精对盐酸舍曲林异构体手性选择包合和色谱保留行为影响的研究. 色谱2004，11；22（6）:595～600.

[5] 宁风容，黄可龙等.HP-β-环糊精手性流动相HPLC法折分荼普生对映体的色谱保留机制和折分机理研究. 化学通报2006；69（6）:425.

[6] 苏立强，李冲等.高效液相色谱流动相添加剂法拆分头孢氨苄对映体. 药物分析杂杂志，2008；28（6）:921～923.

[7] 药品质量标准分析方法验证. 中国药典2005年版二部附录XIX　A .172～173