主题：【分享】水产品中甲砜霉素残留控制研究

甲砜霉素（Thiamphenicol,TAP）是一种广谱抗菌素，其结构类似于氯霉素，能抑制革兰氏阳性细菌、阴性细菌和一些厌氧微生物，广泛应用于水产养殖当中并且会造成残留。因此，研究和建立检测方法成了当务之急。本研究以多克隆抗体和免疫分析技术为基础，根据酶联免疫原理，建立了快速简便的水产品中的酶联免疫检测方法。另外，还建立了相应的仪器检测方法。

首先通过混合酸酐法合成甲砜霉素与牛血清蛋白偶联物，构建甲砜霉素完全抗原。通过紫外扫描、SDS-聚丙烯凝胶电泳和免疫动物实验，证明了产物合成成功。通过免疫新西兰白兔，得到抗 TAP 的抗血清，抗血清效价高达 1×106。此抗血清分别经过饱和硫酸铵沉淀法、离子交换法和反向免疫亲和层析法纯化后，得到单一特异性的抗体，平均亲和常数为 7.8×10-9mol/L。以此抗体为基础，设计了间接竞争两步酶联免疫检测方法，并优化了缓冲液浓度、pH、吐温 20 浓度等参数。此酶联免疫检测试剂盒检测限为 0.06 ng/mL，血液和组织回收率为 80～110%。通过重复性、检测灵敏度、准确性等指标来评估此方法，并与气相色谱法进行了比较，结果表明，此间接竞争酶联免疫检测方法各项参数均能满足实际检测的需要。

建立和优化了甲砜霉素残留的高效液相色谱法(HP$$lc)、高效液相色谱-质谱法(HP$$lc/MS)和气相色谱-质谱法(gc/MS)的检测方法。方法的回收率分别为：HP$$lc 为78.6～95.4%；HP$$lc/MS 为 72.6～99.8%；gc/MS 为 85.6～101.5%，相对偏差均小于10% ,检出限分别为：HP$$lc 为 8.3μg/kg；HP$$lc/MS 为 0.1μg/kg；gc/MS 为 0.1μg/kg。结果表明，这些方法都能满足实际检测的需要。

以高效液相色谱法(HP$$lc)为检测方法，研究了甲砜霉素在鲈鱼血液和可食性组织里的消除规律。鲈鱼单次口服 5 mg/kg（鱼体）和 30 mg/kg（鱼体）的甲砜霉素药物后，药物在血液中的达峰时间分别为 6 小时和 8 小时，药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时；甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程：C=10.812(e-0.087t– e-0.274t)，药物在鲈鱼血液中的吸收半衰期为 1.997 h,消除半衰期为 5.589h；连续 5d 口服 15 和 30 mg/kg（鱼体）的甲砜霉素，药物的吸收速率是一个常数，它在血液中的消除速率也是一个常数，这和单次口服结果一致，其消除速率方程分别为C血液=0.849e-0.494t ；C肌肉=1.461e-0.682t，药物在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为1.016d 和 1.403d；通过 EMEA/CVMP/036/95 所规定的统计方法计算休药期，根据 95%的忍受限和最大残留限量，确定了5d和6d分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期。
缩写符号说明

ELISA 酶联免疫吸附测定法

TAP 甲砜霉素

TMS 四甲基硅烷

BSTFA N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺

TMCS 三甲基氯硅烷

CMOs 转基因生物及其产品

BSA 牛血清蛋白

OVA 鸡卵清蛋白

RSA 兔血清蛋白

HAS 人血清白蛋白

TAP-HS 甲砜霉素半琥珀酸酯

SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳

Tween20 吐温 20

PEG 聚乙二醇，

TMB 四甲基联苯胺

HRP-IgG HRP 标记的羊抗兔 IgG

OPD 邻苯二胺

SylonHTP 六甲基二硅胺-三甲基氯硅烷-吡啶

SylonBFT N,O-双三甲基硅烷基三氟乙酰氨-三甲基氯硅烷

MRLs 最大残留限量

FEDESA 欧洲动物卫生联盟

NOAEL 最大无作用剂量第一章 绪 论

第一章 绪 论

1.1 水产食品产业背景

水产食品营养丰富、味道鲜美，并具有高蛋白、低脂肪、营养平衡性好的特点，成为人们摄取动物性蛋白质的重要来源之一，是合理膳食结构中不可缺少的重要组成部分，在国民经济中占有重要的地位，对于丰富“菜篮子”，改善人民的生活质量发挥着越来越大的作用。目前全球水产品总产量已达1.2亿吨，其中约70%作为原料用于生产水产食品，其余约30%的低值鱼用于制造饲料鱼粉。改革开放以来，我国水产业取得了举世瞩目的成就，然而，值得注意的是，虽然我国水产品出口呈现出良好发展势头，但与我国水产品生产总量相比，出口量仅占总量5%，我国水产品出口额在世界水产品贸易中仅占8%。这充分说明，我国虽然已经成为世界水产生产大国，但是，离世界水产贸易强国还有很大距离。在水产品的国际贸易中，我们与发达国家存在较大距离，同时也说明，我国在水产品国际贸易中还有非常巨大的市场开发与发展潜力，我们完全应该争取扮演更加重要的角色我国水产品对外贸易自20世纪90年代后增长很快。2004年，我国水产品出口大幅增长，出口量和出口额分别达到242.1万吨、69.7亿美元，同比分别增长15.1%和27%；实现贸易顺差37.3亿美元，同比增长24.3%。水产品出口占农产品出口总额的29.7%，继续居大宗出口农产品首位。2005年，我国水产品进出口贸易继续保持稳步增长，但出口增长势头减缓。全年进出口总量623万吨，进出口总额120.1亿美元，其中出口量257万吨，出口额78.9亿美元，分别比上年增长6%和13%，出口量增幅回落9个百分点，出口额增幅回落14个百分点；进口量366万吨，进口额41.2亿美元，分别比上年增长24%和27%；贸易顺差37.7亿美元，与2004年持平。水产品出口额占农产品出口总额的28.6%，继续位居大宗农产品出口首位。

全球水产品的贸易自由化和市场的繁荣，已经使水产品贸易和进出口量已不单纯像以前那样要解决水产品的“互通有无，调剂余缺”的问题，而是像其他加工制造业那样，赚取宝贵的外汇。质量决定效益，国际市场的竞争，促进了水产品生产的国际化。主要体现在水产品标准、检验和质量控制的国际化；对水产品安全卫生的认识与标准的统一；以HACCP为基础的质量管理规范在全球广泛推行；发达国家的水产品质量控制与进口的法规对发展中国家的延伸与影响；在强调环境卫生的同时可能出现的国际贸易技术壁垒。

利用水产品安全和质量管理制造诸多技术性贸易壁垒是最近几年的国际贸易中的突出现象。世界上主要水产品进口国都是发达国家。他们以科技和管理的优势较早的按WTO规则制定相应水产品安全管理法规，使发展中国家在水产品出口贸易中备受制约。我国已接连二次受到欧盟的进口禁令即是证明之一。水产品质量安全问题对内关系到广大人民群众的身体健康、社会的稳定以及水产行业的持续发展，对外关系到促进我国水产品出口换汇、国际市场的开拓扩大。从这两方面来看，深入研究水产品的安全与质量管理已刻不容缓。

近20年来，随着环境污染加重，水产养殖药物的滥用和超量使用，添加剂的滥用以及掺杂使假等，我国水产品质量安全存在的问题越来越复杂。20世纪90年代中后期以来，世界几个主要水产品进口国对我国的水产品采取了一系列的禁令或严格的技术性贸易措施。1996年欧盟禁止从我国进口水产品主要是因为我国监测体系不完善；1998年国家检查的产品质量合格率为47.8%，特别是冻虾仁产品的质量水平很低，内销产品的合格率尚不足40%；02年9月底，欧盟因氯霉素残留问题将中国产冻虾产品纳入其食品快速预警机制后，又于03年初通过决议，自2月1日起全面暂停从中国进口动物制品。03年4月，美国食品和药物管理局在接获从中国进口的虾和淡水螯虾中含有氯霉素的报告后，开始严格检查进口虾类中是否含有这种抗生素的残留物。03年3月中旬，日本厚生省宣布对我国动物产品实施严格检查，使我国出口到日本的鳗鱼全面停滞。


1.2 抗生素残留可能产生的危害性

1.2.1 抗生素残留对我国水产养殖业的影响

抗生素是微生物(包括真菌、放线菌和细菌)在其代谢过程中产生的物质，这种物质在很低的浓度下能抑制其它微生物。从1942年青霉素首先被临床应用后，抗生素在临床上的应用已有60余年历史，使许多细菌性感染得到了控制，对人和动物的医疗工作特别是在防治传染病上起到了重要作用。但近年来，随着抗生素的广泛应用，滥用抗生素的现象越来越严重，由此产生的危害已受到人们的普遍关注，合理使用抗生素具有十分重要的意义。

水产动物产品中抗生素残留主要是由于不合理使用抗生素防治水产动物疾病和作为饲料药物添加剂长时间使用而引起的。由于抗生素的超剂量长时间使用导致抗生素在水产动物中残留，已成为国际市场对我国水产品设置的主要贸易壁垒之一。水产品中抗生素残留现已成为影响我国水产品进入国际市场的关键。鳗鲡养殖和加工是20世纪90年代以来在我国沿海地区如广东、福建等地区发展起来的具有高附加值的三高农业产业。我国的鳗鲡及其制品主要出口日本，但在1995～2000年间，日本市场多次退回并销毁抗生素超标的我国鳗鲡及其制品，给我国造成了巨大的经济损失，极大地损害了我国水产品在世界贸易中的形象。从1996年起，欧盟禁止我国水产品进入欧盟市场，使我国渔业失去了巨大的市场。1997～1998年欧盟官员连续两年对我国进行考察，一直认为我国水产品在养殖过程中用药混乱，政府对药物残留监控不力。

1999年，欧盟在第3次对我国考察后，对我国在渔药残留方面所进行的积极努力给予认可，并决定对我国水产品开放市场。但在2002年1月31日，由于我国动物性产品中药物残留（如氯霉素等）问题，欧盟食物链与消费品管理委员会通过决议，自该年2月1日起全面暂停从我国进口动物性产品，这些都严重影响了我国水产养殖业的持续健康发展。我国现已加入世界贸易组织，今后发达国家低价、低残留的水产食品势必大量涌入我国，如果不积极采取有效措施，不但我国的动物性食品出口不畅，而且在国内市场的地位也会受到严重冲击。

1.2.2 细菌耐药性增加

抗生素对不同病原微生物的抗菌效力并不一致，这主要是由于微生物在药物敏感性方面存在差异。根据这种差异将不同的菌种对同一抗生素的敏感性分为高度敏感、中度敏感、轻度敏感和耐药等四种情况。细菌是通过药物靶酶的改变、代谢途径的改变、通透性屏障和产生灭活酶或修饰酶等机制产生耐药性的。在抗生素广泛使用之后，敏感菌受到抑制，耐药菌的增殖不受影响而流行起来，如金黄葡萄球菌，初用青霉素时耐药菌只有8％，现在医院内感染的耐药菌竟高达80％。在抗生素治疗过程中，细菌的耐药性可以遗传给下一代，也可以经转导、结合、转化等方式自耐药菌转移给敏感菌，敏感菌变为耐药菌，即获得耐药性。一般的规律是抗生素在开始应用时疗效好，渐渐出现耐药，最后大大丧失治疗价值。由于致病菌耐药性的不断增加，使抗生素的药效越来越低，使用标准给药剂量已经不能起到防病治病的作用，必须不断加大剂量才可能有效，甚至完全无效。最显著的例子为喹诺酮类药物，在短短的上市几年中山东所有地区致病菌对其均产生抗药性。在我国不少地区，为了维持其效用，金霉素的饲料添加量已经上升为推荐量的2～3倍，在中东部经济发达的省份和抗生素应用频繁的地区，志贺氏菌几乎100% 具有抗药性，四环素类抗生素尤其明显。这使得抗菌药物的寿命也逐渐缩短，要求不断开发新的品种以克服细菌的耐药性。据日本明治制药1996年统计[1]，从动物分离的沙门氏菌，耐四环素的比例分别为：家禽10%、猪58%、牛85%；耐链霉素的比例分别为：家禽8.8%、猪44%、牛34%。刘永先等[2]报道了1998年延安地区1230株临床分离菌对常用抗菌药物的耐药性。G+菌对青霉素的耐药率达98%，对头孢菌素耐药率为10%~20%。G-菌对氨苄青霉素的耐药率为80%，对头孢菌素的耐药率为30%，对氟喹诺酮类药物的耐药率为10%~20%。李春梅等[3]从临床标本中分离的耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)对青霉素G、氨苄青霉素、头孢噻吩、庆大霉素、环丙沙星、林可霉素及红霉素均有高度耐药。

细菌产生耐药性的速度不断加快，耐药能力也不断加强。这使得抗菌药物的使用寿命也逐渐变短。要求不断开发新的品种以克服细菌的耐药性。然而开发出一种新药并非易事，研制化学合成抗菌药周期长，技术要求高，投资大，且成功率较低。据估计，一种新的抗生素从开始研制到临床应用约需l亿美元以上，对于致病性细菌的耐药性若不采取有效措施，在不久的将来，人和动物的细菌病将面临无药可用的境地[4]。

1.2.3 微生态平衡问题

水产动物肠道中存在大量的微生物，它们是水产动物与外界环境，饲料等接触过程中形成的，根据它们对水产动物所造成的影响，可以大体将肠道微生物分为有益菌群和其它条件型细菌两类。在正常情况下，肠道菌群在数量，种类和定植部位上保持平衡，当该平衡遭到破坏时，就会抑制水产动物的生长，使水产动物对疾病敏感。抗生素特别是广谱性抗生素，在杀灭病原菌的同时，也将抑杀对水产动物胃肠道有益的菌群，造成机体内菌群失调，从而诱发消化功能紊乱[5]。

1.2.4 抗生素残留对环境的影响

在过去的50年中大约有100万吨的抗生素被释放到生物圈中。欧洲动物卫生联盟（European Federation of Animal Health ，FEDESA）对欧盟和瑞士抗生素使用统计数据表明，仅1997年用于人类健康的抗生素达5460吨，用于动物健康的抗生素达3465吨，用于动物生长促进剂的抗生素达1575吨，并有逐年增加的趋势。

Hamscher G等[6]报道绝大多数抗生素排入环境以后，仍然具有活性，会对土壤微生物、水生生物及昆虫等造成影响。Dijek PV等[7]发现，21种饲料添加的抗菌药物对土壤和水中的36种典型的微生物只有7种敏感，其他29种微生物对这些畜禽常用抗菌药都有天然的耐药性，环境对药物还有稀释作用。因此，抗菌药残留对环境微生物生态的影响应该很小。低剂量的抗菌药长期排入环境中，会造成敏感菌耐药性的增加。

耐药基因不但可以贮存于水环境中，而且可以通过水环境扩展和演化。Wollenberger L等[8]报道畜禽常用抗菌药甲硝唑、喹乙醇、萘啶酸、土霉素、泰枚霉素、泰乐菌素对甲壳细水蚤的作用，发现喹乙醇对甲壳细水蚤的急性毒性最强，对水环境有潜在的不良作用。

1.2.5 抗生素残留对生物体的危害

抗生素残留指的是在水产饲料中使用抗生素后，饲用抗生素以原形或中间代谢产物在水产动物的细胞、组织或器官中蓄积的现象。抗生素残留的危害主要表现有对水产动物本身产生的危害和由于饲用抗生素在水产品中的残留对人体产生的危害。第一，大量抗生素被水产动物机体摄入后，随血液循环分布到各组织器官，一方面动物机体的免疫能力被逐渐削弱，另一方面还会影响免疫过程，对疫苗的接种产生不良影响。第二，药物残留对人体的危害通常不表现为急性中毒，而是呈现慢性作用，因而常被人们所忽视，当摄入药物残留一段时间，药物在体内蓄积达到一定量后，会对人体造成一定的危害。主要包括变态反应与过敏反应、细菌耐药性、二重感染、致畸作用、致突变作用、致癌作用和激素样作用等[9,10,11,12,13]。在水产动物产品的残留也会造成一些潜在的危害。如：氯霉素可抑制母髓造血功能，引起再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症；呋喃唑酮可引起溶血性贫血、多发性神经炎和急性肝坏死等；四环素类可抑制幼儿牙发育和骨骼生长；链霉素等氨基糖甙类抗生素损伤听神经和肾功能[14]。

抗生素的副作用以及耐药菌株的存在严重威胁着人类的健康，而且长期饲用低剂量抗生素更容易促使抗药性基因的转移，使动物肠道的正常菌群成了耐药基因的储存库，并不断地将耐药基因转移给致病菌，在人和动物中交叉传播[15]。残留在动物性食品中的抗生素被人们食用后也威胁人类尤其是孕妇和婴儿的健康，而这一点恰恰是人们认识的盲点，并且很容易被忽视。

1.3 当前鱼药残留的控制问题

1.3.1 药物残留及有害物质残留的检测被动落后

往往是进口国提出因某种药残检出，不符合要求而禁止水产品进入，才引起我国上下重视。而我国或是检测技术水平(最低检出限)不行，或是尚未建立确定统一的检测方法。输欧虾仁氯霉素、输日鳗鱼恩诺沙星等事件均是如此。

以氯霉素(CAP)事件为例，其残留问题已引起国际组织和世界上许多国家和地区的高度重视，欧盟、美国等均在法规中规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”(Zerotolerance)，即不得检出。由于存在多种CAP残留的检测方法，因此各种方法的检出限问题已成为关注的焦点。发达国家对检出限的要求越来越严格。欧盟由原来的10μg/kg改为1μg/kg，继而又降至0.1μg/kg，比原标准要求提高了100倍；美国FDA规定的检出限也由原来的5μg/kg改为1μg/kg，接着降为0.3μg/kg，且目前正在研究应用更为灵敏的方法，可使检出限值达0.1μg/kg。水产品中氯霉素残留检测方法的检出限已在国际贸易合作中成为新的技术性壁垒。而目前我国检出限的水平在1μg/kg，很难在激烈的国际贸易竞争中取得有利的地位。

1.3.2 残留监控中的共性和关键技术

有效实施药残监控工作是一项复杂的系统工程，它涉及多方面的工作。首先要建立一套有效的药物残留监控体系与食用水产品的安全生产体系。我国实施的药物残留监控计划即是实施药物残留监控的法规性文件，它包括建立药物残留监控计划的法律法规基础，药物残留监控工作的管理与组织机构，企业的协同责任，官方主管部门的控制措施，官方或官方认可实验室，官方的取送样程序等。实施药残监控工作不仅要求官方主管部门加强对各种药物分销、使用与加工企业加工过程的监督管理，加强官方主管部门间信息通报，也要求官方部门建立一套完整的官方样品抽取、传递体系，建立一套认可的实验室(包括标准实验室与常规检测实验室)检测体系，更要求生产加工企业建立自身的药物残留自控体系。

在实施兽药残留监控过程中共性的和关键的技术，除严格加强管理促进科学合理地使用兽药外，建立简便、快速、灵敏的兽药残留分析方法是进行残留监控的关键技术。

总结国际上动物性产品中兽药残留监控的经验，可以看出兽药残留监控检测方法的发展趋势是：先用快速检测方法(如酶联免疫吸附法)对大批样品进行快速筛选，筛选出的可疑样品再用仪器方法(如气质联用、液质联用)进行确证。这样既节省人力、财力，又能及时、有效地对动物性产品中兽药残留进行监控。

近两年，农业部一直在组织兽药残留检测方法的研究工作，到目前为止，共发布了几十种兽药在动物性产品中的残留检测方法，为我国动物性产品中兽药残留检测提供了必要的依据。但这些方法大多是仪器方法，主要应用的仪器有高效液相色谱仪、气相色谱仪、液质联用仪、气质联用仪。由于这些仪器价格昂贵且方法操作复杂，存在检测成本高、检测周期长等缺点，不适宜大规模普查、监控。因此，迫切需要发展简便、快速、灵敏、特异性强，并能同时处理测定大批量样品的兽药残留分析技术，建立与国际接轨的兽药残留检测方法标准，缩小我国兽药残留检测方法及检测技术与先进国家的差距，将有利于我国动物性产品中兽药残留监控水平的提高，有利于我国的检测数据在国际贸易往来中得到国际认可。

1.3.3 残留监控中要解决的关键技术

(1) 残留快速检测技术研究

免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度，仪器化程度低，样品前处理简单，使用方便，适用于现场监控和大量样品筛查。酶联免疫吸附测定法(ELISA)是目前应用最广泛的免疫分析技术。利用胶体金颗粒作为标记物的试纸条检测技术、偏振荧光免疫分析技术、免疫传感器等也有较大发展。免疫学检测方法是适用于基层的大规模筛选的快速检测方法，更实际更有应用前景。国内目前尚未研制出商品化的检测兽药残留的试剂盒，残留监控中主要使用国外进口的ELISA试剂盒，成本高，推广难度大，不利于我国兽药残留的监控。研究和开发具有我国独立知识产权的检测技术和产品，生产成本将大大低于国外产品，从而降低检测成本，具有很强的市场竞争力和推广前景。对提高我国食品安全检测技术水平，实现大规模普查、监控，加强我国兽药残留监控的力度，促进相关产业的形成具有十分深远的意义。

(2) 样品的分离、纯化技术

免疫亲和色谱技术、分子印迹技术、基质固相分散技术等是残留分析中最有效的分离纯化方法，目前是残留分析领域中的研究热点。免疫亲和色谱技术具有高度的选择性和特异性，特别适用于复杂样品基质中痕量组分的分离。可利用色谱柱技术制备出用于药物多残留检测的样品分离纯化IAC柱。该技术的发展方向是使生物样品中多个药物同时得到高效分离纯化，而且极有可能使将几类不同药物残留在同一根IAC柱上得到分离纯化这一多年来残留分析工作者的愿望变成现实，因此，该项研究具有重要的理论指导意义和较强的实用价值。分子印迹技术在残留分析领域的应用研究国外也刚刚起步，是残留分析研究领域的一个新的发展方向。

(3) 药物多残留定量确证技术研究

免疫亲和色谱-色谱-质谱检测技术与在药物残留研究中采用的色谱/质谱联用技术，可以集高效分离和结构鉴定于一体，是生物样品复杂混合物中痕量组分定性和定量分析的最有效手段之一。国内外有关兽药残留多残留分析的大部分报道主要集中在兽药残留的液谱-单个质谱联用技术的研究上，液谱-串联质谱($$lc/MS/MS)联用技术在兽药残留分析中取得应用。另外，色谱/质谱联用检测技术对待测残留物纯度的要求极为严格，一般的样品前处理技术很难达到满意程度。兽药多残留的IAC分离纯化技术$$lc/MS/MS和gc/MS检测兽药残留时最有效的分离纯化手段。建立动物性食品中药物多残留的定量确证检测技术(IAC/gc/MS、IAC/$$lc/ MS

/MS)，是残留分析研究领域的一个重要发展方向。

1.3.4 我国食品残留科技研究的状况

我国兽药残留监控工作始于20世纪90年代初，1991年国务院办公厅发布了《关于加强农药、兽药管理的通知》。根据国办通知要求，农业部发布了《关于开展兽药残留检测工作的通知》，要求各地畜牧兽医行政主管部门负责本地兽药残留项目及检测工作的监督管理，并将兽药残留监控工作纳入兽药的管理范畴。1999年，农业部与原国家出入境检验检疫局结合我国的国情并参考国外有关法规制定发布了《中华人民共和国动物及动物源性食品中残留物质监控计划》，同时发布了《官方取样程序》。2001年，为保证动物性食品的安全，加强兽药残留监控管理工作，国务院在新修改的《兽药管理条例》中规定，县级以上人民政府畜牧兽医行政主管部门应当加强对动物产品中兽药残留的检测，并公布检测结果；兽药残留限量标准和检测方法由国务院畜牧兽医行政管理部门制定。这标志着我国的动物源性食品中兽药残留的监控工作已初步步入法制化、规范化的管理轨道。

1994年，农业部制定并发布了34种药物的最高残留限量标准；1997年修订了最高残留限量标准；1999年再次修订并颁布了109种兽药在动物性食品中最高残留限量标准；2002年参考美国、欧盟、食品法典委员会(CAC)等发达国家和组织的作法，再次修订并颁布240多种兽药在动物性食品中最高残留限量标准。2001年，农业部发布了10种动物源性食品中兽药残留检测方法，2002年，农业部发布了12种兽药在动物性食品中残留监测方法标准。兽药残留监控是一项政策性、技术性都非常强的工作，为此农业部于1999年底成立了全国兽药残留专家委员会。该委员会是在农业部领导下的技术审议咨询组织，委员主要由食品卫生、进出入境检验检疫、农药残留监控、兽药残留监控和体育运动兴奋剂检测等方面的专家组成。自1999年以来，我国已连续4年开展了动物性食品中兽药残留的监测工作，监测地区、动物种类、兽药种类、样品数量每年都有大幅度的增长。

经过十几年的工作，我国在兽药安全性评价、残留检测方法、最高残留限量和休药期的制定方面取得了很大进展，但在检测数量、范围、品种和检测技术上与发达国家相比仍有很大的差距。到目前为止，有关兽药安全评价和残留检测方法等仍主要是参考国外的资料进行研究，现在国内只有极少数单位能完成兽药安全性评价中某些方面的研究，且这些单位的实验条件均不能达到国外同类实验室的水平。目前影响我国兽药残留监控计划顺利实施的因素除了社会和管理的原因外，主要是由于我国的兽药残留监控工作起步较晚，基础薄弱，检测方法不完善，检测机构的仪器设备陈旧，检测水平不高。兽药残留检测技术的科技研究水平落后于发达国家。因此，加大资金投入，加速我国兽药残留检测方法的标准体系建设和监测体系建设是当务之急。借鉴国外先进经验，全面推动我国兽药残留监控工作与国际接轨，加强国际交流和合作，引进国外先进技术，使我国的兽药残留限量标准、检测方法标准等尽快与国际接轨，力争在一个较短的时间内使我国的兽药残留监控工作水平上一个新的台阶。
1.3.5 残留消除研究和休药期标准制定

在动物性食品兽药残留监控过程中，最高残留限量和休药期是两个十分重要的标准。前者是监控的依据，后者是用药的依据，二者共同构成了兽药残留监控的基础。遵守最高残留限量和休药期标准的规定是避免兽药残留超标，确保动物性食品安全的关键。最高残留限量(MRLs)是指对食品动物用药后产生的允许存在于食品表面或内部的残留药物的最高含量或最高浓度。兽药的安全性、使用范围和分析方法是建立最高残留限量的基础，其中安全性是决定性的。制定最高残留限量的步骤通常包括确定残留组分，测定药物的最大无作用剂量(NOAEL)，估计危害性程度(安全系数)，确定食物消费系数等。

通过药物代谢动力学的研究可以明确兽药残留组分，如原形药物和代谢产物确定标示残留组分和残留检测的靶组织。通过安全性毒理学评价研究，如毒理学试验包括亚慢性试验、慢性试验(含致癌试验)、繁育试验(生殖毒性、致畸作用、发育毒性等)等，确定药物的最大无作用剂量，在综合考虑人和实验动物之间对药物的敏感性差异，结合人体对动物性食品消费情况的前提下，制定出动物性食品中兽药的最大残留限量。

休药期(withdrawal time)是指食品动物从停止给药到许可屠宰或它们的产品(即动第物性食品，包括可食组织、蛋、奶等)许可上市的间隔时间。凡供食品动物应用的药物或其它化学物，均需规定休药期。休药期的规定是为了减少或避免供人食用的动物组织或产品中残留药物超量，进而影响人的健康。在休药期间，动物组织或产品中存在的具有毒理学意义的残留可逐渐减少或被消除，直到残留浓度降至“安全浓度”即“最高残留限量”以下。在给食品动物使用药物时，在用药期间和用药后的一定时间内，不能将动物屠宰出售或其产品(奶、蛋)上市，否则，会引起动物性食品中药物残留量超标，危害人体健康。影响动物体内药物残留消除及休药期的因素很多，如药物剂型与剂量，给药途径，合并用药和重复用药，动物年龄、性别、品种及个体差异，胃肠道环境及机能状态等均能影响药物在机体内的吸收、分布或代谢，进而影响药物从体内消除和休药期。所以用科学方法来制定休药期非常重要。

制定休药期的程序一般包括确定靶组织和被测残留物，研究组织残留消除规律进行数据统计处理。较为常用的方法是实验动物经过预试后，按实际给药量和给药途径给药后，取若干个时间点(在MRLs附近至少设4个采样时间点)采靶组织样品进行残留测定绘制残留消除的半对数曲线，利用直线回归方法对数据进行统计处理，将MRLs作为统计量估计时间的99％置信限，取其上限时间作为休药期。另外，也可根据组织药物代谢动力学参数来估算休药期。

动物体内兽药残留消除规律的研究，是制定休药期标准的关键。结合我国畜牧业生产以及常用兽药及饲料药物添加剂等的使用情况，研究兽药在不同种类畜禽体内的残留消除规律，制定符合我国实际情况的各种药物休药期标准，对明确规定允许使用兽药的畜禽种类、用药时期、药物种类和剂量，明确规定禁止使用的兽药和其他化合物的种类，促进科学、合理地使用兽药具有重要的战略意义，可为全面建立畜禽产品的安全监测体系、残留监控的法律法规和技术标准体系，以及对畜禽产品中兽药残留进行监控提供科学的数据和理依据。

1.4 抗生素在水产动物体内消除规律研究进展

1.4.1 组织动力学简介

药物组织动力学(tissue kinetics)是药代动力学(pharmacokinetics)研究的一个较新领域，是应用动力学原理探讨化疗药物在机体组织中的动态变化规律。其通过测定不同器官组织中药物浓度与时间之间的关系，阐明药物在不同器官组织中的动力学特征，较真实的反应药物在机体各组织中的分布和动态变化规律。通过监测药物组织浓度，了解靶器官组织的药物浓度与时间的关系，可为组织感染的化疗提供直接的理论依据，对制定药物最高残留限量与休药期具有重要价值。

1.4.2 几种抗生素类药物在水产动物体内的药代动力学研究

1 ）氯霉素

氯霉素在生产中曾广为使用，但由于其对人类有致再生障碍性贫血的副作用, 现已禁止在食用动物养殖中使用。氯霉素在鲤鱼、鳟鱼、草鱼、银鲫、对虾等体内的药代动力学研究已见报道。李兰生等[16]报道了对虾体内氯霉素含量测定方法的研究，应用高效液相色谱(HP$$lc) 技术，采用大剂量投喂,分别测定各组织中药物浓度，再计算出体内药物总剂量。李爱华[17]报道了氯霉素在草鱼和复合四倍体异育银鲫体内的比较药代动力学,采用HP$$lc法测定血液中氯霉素的浓度，单次注射给药。Nouws 等[18]报道了氯霉素在鲤鱼和鳟鱼体内的药代动力学研究。研究结果均表明氯霉素在体内代谢的半衰期长，残留高。

2）土霉素(OTC)

OTC 是广谱的人畜共用抗生素,广泛应用于水产养殖业细菌性疾病的防治，国内外对该药的研究比较广泛。Rigos等[19 ] 报道了在两种水温条件下OTC 在舌齿鲈体内的药代动力学及组织分布。采用HP$$lc法测定，尾静脉注射给药。结果显示血浆药物浓度-时间数据符合二室模型。药物动力学特征与温度相关,温度高，组织中OTC 消除快，而在同样温度条件下，肝脏中OTC 消除速度比肌肉中快。王群等[20]报道了OTC在黑鲷( Sparus macrocephalus) 体内的药代动力学研究， HP$$lc 法测定，1次口服给药。结果表明血药浓度-时间数据符合一室开放动力学模型，药动学参数表明OTC 的吸收、消除速度缓慢。Haug等[21] 报道了土霉素在淡水北极红点鲑( Salvelinus alpinus) 体内的药代动力学。HP$$lc法测定，口服和注射给药。注射给药符合三室模型，口服油脂颗粒与OTC的吸收无协同作用，不能增加OTC 的生物利用度。Abedini 等[22]报道了土霉素在淡水虹鳟和海水大鳞大麻哈鱼( O.tshawytscha)体内的比较药代动力学和生物利用度。单次注射和口服给药，HP$$lc法测定血液浓度,两种鱼注射给药后药动学模式均符合三室开放模型，口服给药符合二室开放模型。给药方式相同时,在鳟鱼和鲑鱼得到相似的OTC 血药浓度-时间曲线图，药动学参数和表观生物利用度也非常相似。结果表明在鲑科鱼体内,种属差异和盐度对OTC 的吸收和消除影响不大，淡水鳟鱼和海水鲑鱼都可用于研究OTC 在鲑科鱼体内的药动学模型。Uno[23]报道了土霉素在健康和感染弧菌的香鱼体内的药动学研究，HP$$lc 法测定血药浓度。对健康香鱼采用尾静脉注射和经口灌服两种给药方式，感染弧菌的香鱼灌服给药。结果显示，健康香鱼注射给药后，药动学符合二室模型，口服给药的健康香鱼和感染香鱼其药物在体内的代谢均不符合用非线性最小二乘法拟合的一级吸收一室或二室模型。健康香鱼与感染弧菌香鱼的口服生物利用度差异显著，二者对药物的消除相似。另外，国外学者还报道了土霉素在大西洋鲑、鲤、非洲鲶、鲷和鲈、银大麻哈鱼(O.kisutch) 、琵琶湖大麻哈鱼(O.rhodurus)、五条魳(Seriola quinquera-diata) 、欧鳗等鱼体内的药代动力学研究[18, 24～32]。关于OTC 残留的研究，Mohney 等报道了OTC 在养殖细角对虾( Penaes styli rostris) 幼体中投喂14 d 药饵的残留情况，Bebak Williams等[34]报道了OTC 在淡水虹鳟循环养殖系统中鱼体及周围环境中的残留；Xu 等[35]报道了土霉素在条纹鲈( Morone sax atilis)肌肉中的残留研究；国内的辛福言等[36]报道了HP$$lc 法分析鲤鱼体内OTC 残留的研究；李美同等[37 ]报道了OTC 在鳗鲡组织中残留的消除规律； 陈四清等[38] 报道饲喂土霉素对鲤鱼生长及代谢残留的研究等。研究结果表明，虹鳟、鲑鱼休药21 d (水温11.5℃ ) ，条纹鲈停药16 d (水温23 ℃ )，对虾、鳗鲡休药7 d (水温23～27℃  )，组织中不再检出；鲤鱼停药5 d (水温22～28 ℃ )后可达食用标准。
3）氟苯尼考

氟苯尼考在畜禽,如牛、猪、鸡、鸭等体内的药动学研究已有报道，在水产动物体内仅对大西洋鲑有过报道。Martinsen 等[39]报道了氟苯尼考在大西洋鲑体内的单剂量药代动力学研究，Horsberg 等[40]报道了14C-氟苯尼考在大西洋鲑体内的动力学过程，Horsberg等[41]报道了氟苯尼考在大西洋鲑体内的药代动力学及其代谢产物的研究。研究中分别采用了HP$$lc、全息显影(WBA) 和液体闪烁记数(LSC)法。研究结果表明，单剂量注射给药的代谢过程符合二室开放模型，口服生物利用度高,体内清除迅速，其主要代谢产物为胺类，用药观察结果表明没有不良反应。

4) 喹诺酮

Samulesen等[42]报道了FQ在大比目鱼中残留规律和代谢动力学。采取给静脉注射和口服两中方式。注射后血液中的FQ的分配和消除半衰期分别为0.8 h和43 h，血液中最高浓度是601 mg/L , 所需的时间是10 h ，生物利用度为69 % ，口服仅为31 %。在给大比目鱼注射水平为25μg/g 10 d 后，残留水平仍然超过0.25 mg/L，为最低残留限量(0.0626mg/L) 的4 倍。相应的口服为5 d。Malvisi等[43]研究了FQ在鲷科海鱼体内的分配和代谢残留规律。每天以12μg/g 的剂量连续喂药5 d，24 h 后, 皮肤中药物含量达到最高, 为317ng/g±102.6ng/g ， 此时组织中的药物含量为68.7 ng/g±49.6 ng/g。肌肉中FQ在240 d后未检出,而皮肤中则需要更长时间。张雅斌等[44 ]通过不同给药方式研究了鲤鱼对诺氟沙星的药代动力学。以10μg/g 的单剂量肌肉注射、口灌诺氟沙星的药时数据符合开放性二室模型, 以10μg/g 的药物剂量单次混饲给药时数据符合开放性一室模型。研究结果表明, 不同的给药方式的药物代谢动力学差异较显著,诺氟沙星吸收快, 但消除速度慢。

1.5 食品中 TAP 的分析方法

1.5.1 发展概述

兽药残留分析(drug residue analysis)属复杂基质中痕量组分的分析技术，与药品或制剂分析有很大不同。兽药残留分析（以下简称“残留分析”）的方法特点可概括为3个方

面：

1）待测物质浓度低，浓度波动范围大

这是残留分析的显著特点，多数残留水平为1 pg/kg～1 mg/kg。药物在体内经过吸收、分布、代谢和排泄过程，药物被代谢和稀释，浓度变化可分为潜伏期、持效期和残留期。残留期浓度较持效期一般低2～3个数量级，浓度变化的动态范围达1:1 000以上。实际残留测定或监控通常在MRLs水平(μg/kg级)上进行，如食品残留监控和休药期预测，既要求准确定量和定性，又需要考察动力学情况，对方法的可靠性(灵敏度、准确度和选择性)要求极高。

2）样品基质复杂，干扰物质多

生物材料的成分十分复杂，组成生物的分子种类和数量不计其数，而且对它们确切的理化性质了解甚少，不同种属动物的样品、同种动物的不同组织器官的成分也存在明显差异，这是导致残留样品干扰物质复杂和方法通用性差的主要原因。其他干扰因素，有药物自身的代谢产物、动物日粮成分和环境污染物等。

3）以各种仪器分析方法为主

这是由残留分析对象和仪器分析方法的特点决定的。残留样品要求分析技术具有灵敏度高、选择性或分离能力强和线性范围宽的特点。显然传统意义上的化学分析方法通常不能独立进行残留分析。

1.5.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法是一种灵敏度较高、可靠性较强的方法。此法重复性好、假阳性少，可以进行定量鉴定，但检出限较高，为5～10μg/kg，回收率偏低。因为动物体内成分复杂,一些杂质干扰测定，应用该法检测时，对于样品预处理必须仔细谨慎，以提高测定准确性和灵敏度。

Lawrence 等[45]研究报道了检测牛血清中甲砜霉素的液相色谱法。用乙酸乙酯提取组织中的甲砜霉素,蒸发至干，用流动相将残存物溶解。液相色谱分析采用了 UltrasphereC18 色谱柱，紫外检测器检测，回收率达 90.0%以上，检测限为 0.1μg/mL。Psomas 等[46]研究了牛肉中甲砜霉素残留的高效液相色谱检测方法。用乙酸乙酯提取组织中的甲砜霉素,蒸发至干，将残存物溶于 4%的 NaCl 溶液中，加适量正己烷后，用乙酸乙酯提取。

液相色谱分析采用了 Hichrom C18 色谱柱，紫外检测器检测，回收率为 64.8～75.5 %以上，检测限为 5μg/kg。日本 Tomoko Nagaka 等[47]报道了用 2 种波长的液相色谱法对肌肉组织进行多残留分析。该方法用乙酸乙酯提取肌肉组织中的药物，提取液蒸干，残存物溶于 3%氯化钠中并加适量正己烷去除溶液中脂类物质，用 sep-pak Florid 柱提纯净化。色谱条件：Chromatorex ODS 柱,紫外检测器 225nm 或 270nm, 流动相甲醇-水(15∶ 8 5)，最低检测限为 0. 0lmg/kg。氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素平均回收率大于
1.5.3 气相色谱法

气相色谱法的特点是高分离效能、高选择性、高灵敏度、快速、应用广。它可以对于分配系数相差很近的组分进行分离，从而分离出极为复杂的混合物。检出限低，有许多高灵敏、通用性或专一性强的检测器供选用，如氢焰离子化检测器(FID) 、电子捕获检测器(ECD) 、氮磷检测器(NPD) 等，检出限一般为 μg/kg 级，常用于抗生素药物残留的检测。但是大多数兽药极性或沸点偏高,需繁琐的衍生化步骤，因而限制 gc 的应用[48] 。

气相色谱检测法中最为灵敏的方法是 1974 年 10 月 AOAC 年会上由 Jacabson 等[49] 提出的。该方法用乙酸乙酯提取动物组织中的药物,用含 4%NaCl 溶液溶解残渣，正己烷除脂，通过硅藻土色谱柱提纯净化，加入四甲基硅烷(TMS)衍生化，最后进样检测。肌肉样品的回收率大于 80% ，检出限低于 1μg/kg。色谱条件：电子捕获检测(ECD),Gas-ChromQ 柱(含有 4%Se-30)，流动相为氢-甲醇(95:5)。Gazzaniga 等[50]研究报道了血液、尿和组织中的甲砜霉素的气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物，四甲基硅烷(TMS)衍生化。用火焰离子检测器检测,检测限为 0.2～0.4μg/mL。

甲砜霉素的添加试验回收率为 50～80%。Allen 等[51]建立了牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物,四甲基硅烷(TMS)衍生化。用 63 Ni 电子捕获检测器检测,检测限为 0.01μg/mL。甲砜霉素的添加试验回收率为 100%以上。Allen 等[52]建立了对虾组织中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物，四甲基硅烷(TMS)衍生化。用 63 Ni 电子捕获检测器检测,检测限为 5ng/g。甲砜霉素的添加试验回收率为 84%以上。Plomp 等[53] 报道了血液和羊水中甲砜霉素快速气相色谱检测方法。该方法用乙酸乙酯提取体液中的药物,四甲基硅烷(TMS)衍生化。用 63 Ni 电子捕获检测器检测，检测限为0.1μg/mL。甲砜霉素血清的添加试验回收率为 91.3%，羊水的回收率为 90.3%。中国人民共和国行业标准 SN 0199 -93[54]， 规定用气相色谱法测定甲砜霉素残留。其方法是样品中待测物用丙酮提取，提取液离心后加入 3%NaCl 溶液，再用乙酸乙酯提取两次，蒸除乙酸乙酯后，加入乙腈及正己烷，振摇均匀，分取乙腈层，真空除去乙腈。乙酸乙酯+乙酸酐+吡啶乙酰化，用硅胶柱纯化，用配有火焰检测器的气相色谱仪测定。最低检测限为 0.5mg/kg。甲砜霉素浓度在 0.1～1.0mg/kg，回收率为 80%～99%。王建华[55] 研究报道了同时测定鱼肉中氯霉素和甲砜霉素残留量的毛细管气相色谱法。样品中待测物用乙酸乙酯提取,浓缩至干，溶于水用正己烷脱脂，水层过 Sep -C18 小柱净化，甲醇洗脱后用N,O -双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA) +1% ( ф)三甲基氯硅烷(TMCS)衍生,加入甲苯并用水灭活衍生过程,用带有63Ni电子捕获检测器的气相色谱仪检测,外标法定量。当添加水平(W)为 5 ×10 -9～20 ×10 -9 时,回收率为 80%～107% 。相对标准差为4.5%～11% ；线性相关系数 r >0.997 。
1.5.4 气质联用法

Tomoko Nagata 等[56] 报道了用气相色谱-质谱法检测黄鰤鱼肌肉中的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留。该方法采用了对 3 种药物具有相似响应因子的电子捕获检测器(ECD)，使得 3 种药物能在低浓度时同时检测到。用乙酸乙酯提取药物，并将提取液蒸干，残存物溶于 NaCl 溶液中,加适量正己烷去除脂类物质,然后再用乙酸乙酯提取药物,蒸干后将残留物用正己烷溶液和乙醚溶解，用 Sep-Pak Florisil 柱提纯净化，提取物在 50℃条件下经衍生化后，用气谱-质谱联用机检测,药物由包被有 5%苯基甲基硅的毛细管柱分离，回收率大于 65% ，最低检测限为 5μg/kg。

1.5.5 高效液相色谱串联质谱法

陈小霞等[57]研究了鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的高效液相色谱-电喷雾电离三级四极杆质谱检测方法。该方法采用多反应检测负离子模式，可一次对鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定性和定量。该方法对甲砜霉素的检出限为0.010μg/kg，测定限为 0.100μg/kg，回收率为 77.0～88.7%。彭涛等[58]研究了虾中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的高效液相色谱串联质谱检测方法。该方法采用多反应检测负离子模式，可一次对鸡肉中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定性和定量。该方法的对甲砜霉素的检出限为 0.050μg/kg，回收率为 78.6～99.5%。

1.5.6 其它检测方法

Nagata等[59]研究报道了柱液相色谱法检测鸡肉中甲砜霉素残留的检测方法。该方法用乙酸乙酯提取肌肉组织中的药物，提取液蒸干，残存物溶于10%氯化钠中并加适量正己烷去除溶液中脂类物质，用sep-pak Florid 柱提纯净化。液相色谱分析采用了Nucleosi$$lc18 色谱柱，紫外检测器检测,回收率达90.0%以上，检测限为0.05 mg /kg 。
1.6 ELISA 快速检测技术的研究进展

1.6.1 免疫分析概述

免疫分析(immunoanalysis)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键范德华力和疏水区域的综合作用,因而具有单独任何一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度,非常适用于复杂基质中痕量组分的分离和检测。1959年,Yalow和Berson[60]将放射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了放射免疫测定法，从而开创了免疫分析这一崭新领域，公认为痕量分析化学方面的重大突破。在20世纪80年代，免疫分析被引入到环境分析领域。在随后的20年里，在免疫分析形式，提高灵敏度方面有很多突破性进展[61-64]，不同的免疫分析方法被应用到杀虫剂，工业化学物，和微生物毒素检测方面。为了监控药物残留以及有害物质，就需要一种快速，灵敏，经济和高通量的的检测方法，免疫分析符合了这个要求并且被证明可以替代传统的分析方法[65-70]。Van Emon和Gelach[71,72]就环境监控和人体照射研究综述了了免疫分析在这方面的应用和技术进展。对于人们关注的有害化学物质，出现了一些商用试剂盒，这些试剂盒可以用来半定量和筛选这些有害物质[73-77]。虽然不同的免疫分析方法被研究并应用到不同物质的检测，但是ELISA方法是最被广泛接受的[78-83]。免疫分析技术主要包括以下技术：

1）免疫荧光技术

免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体（或抗原，较少用）结合，但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体在作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。免疫荧光技术经济、方便，但易受背景干扰，限制了免疫荧光技术的灵敏度。

2）放射免疫技术

放射免疫技术是将核素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性核素作为示踪无德标记免疫测定方法。此方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点，但是由于用作指示剂的标记物为放射性同位素，检测放射性同位素需要昂贵的仪器设备和辐射防护设施，并需要专门的实验室和放射性废物的处理装置。

3）免疫金标技术

免疫金标技术是以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫技术。胶体金是由氯金酸聚合成特定大小的颗粒，并由于静电作用作为一种稳定的胶体状态，利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷集团吸引而形成牢固结合。胶体金免疫分析具有简便快速的优点，但不能准确定量。

4）免疫化学发光技术

免疫发光技术是将标记有化学发光物质的抗原（或抗体）通过特异性免疫反应与抗

体（或抗原）相结合，通过化学发光反应测定标记物的发光强度以确定被标记抗原（或

抗体）的含量。从标记免疫测定来看，化学发光技术两次测定抗原抗体反应步骤均与酶

免疫测定相同，仅最后一步酶催化反应所用底物为发光剂，通过化学发光反应所发出的

光在特定的仪器上进行测定。

1.6.2 ELISA 免疫检测技术的原理和优势

ELISA是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种

综合性技术。它的基本原理是：使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保留其免疫

活性；抗原或抗体与某种酶联接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫江

活性，又保留了酶的活性。在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固

相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与

其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物以后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与受检标本中的受检物的量直接相关，所以可以根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

与常规的理化分析技术相比，免疫分析技术最突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低。以使用微量滴定板的ELISA为例，免疫测定法取样量小，前处理简单，容量大，仪器化程度低，检测限与gc/MS或gc/ECD相似，可方便地达到ng/g～pg/g级，分析效率则为HP$$lc或gc的几十倍以上；理论上免疫测定法对待测物几乎没有限制，如不存在HP$$lc或gc对待测物蒸汽压、稳定性、卤素、发色团等理化性质的特殊要求，适用于各种类型物质的分析，包括高极性、离子型或大分子化合物。但是，免疫测定法提供的待测物组成或结构方面的信息太少(仅为吸收度或计数)，一般不具备多残留分析能力；免疫分析过程复杂，影响因素众多且不易控制，结果易出现假阳性，方法难以标准化；方法建立过程复杂，研究周期长，某些待测物的半抗原难以合成。免疫测定法不可能取代色谱或光谱等常规分析方法，只能作为其重要补充。

根据免疫分析的技术特点，预期将在现场或实验室大批量样品快速测定中发挥重要作用，如选定残留组分或用药历史已知的样品筛选性分析；对于使用广泛或理化方法测定困难的待测物应考虑发展其免疫分析方法。目前，大部分兽用抗生素和激素类药物已经建立了免疫测定法，如磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、青霉素G、链霉素、四环素、爱比菌素、莫能菌素、19-诺龙、克仑特罗等。
1.7 立题的目的意义和主要研究内容

1.7.1 立题的目的意义

氯霉素类抗生素除代表药氯霉素外，还有甲砜霉素和氟甲砜霉素，其中氯霉素和甲砜霉素已在我国畜牧业中广泛应用，对畜禽疾病控制及治疗起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用,能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病,国际上相继禁止或严格限制使用氯霉素。另外,氟甲砜霉素抗菌活性虽优于氯霉素和甲砜霉素,毒作用也小，但价格较高，目前主要用于对虾、鳗鱼等商检品种，所以作为氯霉素替代品使用的主要还是甲砜霉素。

甲砜霉素血液系统毒性不及氯霉素，抑制红细胞、白细胞和血小板程度比氯霉素轻，但免疫抑制作用比氯霉素强，欧共体和美国均禁用于食品动物。为了保障人民健康与我国的正常贸易，建立高效、灵敏、经济的残留分析方法很有必要。到目前为止，甲砜霉素残留的分析方法最常用的是液相色谱法和气相色谱法。也有波谱法的报道,但该方法耗时又缺乏灵敏性,现已很少使用。随着经济的发展，尤其是中国加入WTO以后，水产品的进出口贸易扩大，人们对食品质量的和健康水平要求越来越高，发展推广简便、快速、灵敏、大通量的检测方法势在必行。

酶联免疫检测技术，使得检测方法的方便和快速两个优点得以同时实现。国际上运用免疫学、生物工程技术针对食品安全建立的快速检测方法，有以下几个方面的特点：

第一，灵敏度高，可达到10亿分之一，甚至更低；

第二，方法的特异性高、假阳性相对较低；

第三，适用范围较宽，可测定各类食品；

第四，检测的费用低。

药残残留快速筛检的试剂盒方面，国外已有不少产品。但是，由于其价格相对昂贵，并需要外汇，不适合我国大规模监测的应用。而能够达到同等性能、并具有我国知识产权的试剂盒目前很少或技术水平不符合要求，这十分不利于我国广大地区的筛检工作的开展。
1.7.2 主要研究内容

本文主要是针对甲砜霉素残留建立高灵敏度快速的ELISA的检测方法，同时考虑到

ELISA方法在检测过程中可能会出现假阳性结果，同时建立了仪器分析的方法。为了防

止甲砜霉素的残留，同时对甲砜霉素的消除规律进行了研究，制定了合理的休药期。

主要研究内容：

1）利用化学方法合成TAP完全抗原并进行鉴定；

2）利用动物免疫技术获得抗TAP的多克隆抗体，并进行纯化鉴定；

3）建立并优化ELISA检测方法；

4）建立并优化仪器分析方法；

5）对TAP在鲈鱼体内的消除规律进行研究，制定合理的休药期；

研究目标：建立和优化针对甲砜霉素的ELISA和仪器检测方法，制定合理的休药期。
第二章 甲砜霉素完全抗原的合成与鉴定

2.1 引言

2.1.1 小分子半抗原和完全抗原

抗原(Antigen，Ag)是能够引起免疫反应的分子，它是形成特异性免疫反应的必备条件，没有抗原的刺激，就没有特异性免疫的形成。只有免疫反应而无免疫原性的物质称为半抗原(hapten)或不完全抗原[1,2]。它们通常不能引起免疫应答，却能与抗体反应，相当于抗原分子上的一个抗原决定簇，即抗原分子上与抗体结合的一个区域。半抗原的分子量很小，本身无免疫原性，但与蛋白质载体结合后即可获得免疫原性，成为完全抗原。

因为蛋白质结构复杂，免疫原性好，所以一般选择各种蛋白质作为载体，如牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、兔血清蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HAS)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin)等。其中最常用的是牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)[1-3]。甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)是小分子化合物，分子量只有 355.0048，是一种典型的半抗原。为了得到半抗原的特异性抗体，首先必须将半抗原与蛋白质载体结合，形成完全抗原。

2.1.2 完全抗原构建的一般原则

一些情况下待测物可作为半抗原直接与载体(一般为蛋白质)连接，但更多情况下待测物不宜作为免疫半抗原，如结构中不具备可直接与载体共价连接的基团，或这些基团对维系待测物的免疫特性和特征结构十分重要，或直接与载体连接后半抗原的特征结构易受载体的局部微化学环境或空间位阻的干扰，影响机体免疫系统的识别等。所以实际中经常根据分析目的和免疫学理论设计模拟原待测物的免疫半抗原。

在合成化学允许的前提下，免疫半抗原设计的基本原则是免疫半抗原与载体连接后在结合抗原中能最大程度保持和突出待测物的特征结构，特别是立体结构。所以，免疫半抗原一般由下列结构部分组成：待测物特征结构、用于连接特征结构和载体的间隔分子和末端的极性基团。间隔分子又称“间隔臂(spacer arm)”。机体的免疫系统对载体远端的半抗原结构部分识别最强，所以在免疫半抗原的设计中间隔臂的位置选择十分重要。间隔臂的位置、结构和性质最能体现一种免疫半抗原的设计意图，可以直接利用待测物中非特征性的结构部分作为间隔臂或自行构建间隔臂。间隔臂应远离待测物的特征结构部分和官能团，与载体连接后最好能够突出这些结构，间隔臂一般应为非极性，且除供偶联的活性基团外不应含有其他高免疫活性的结构，如苯环、杂环、杂原子、羟基等，以降低抗体对间隔臂的识别和间隔臂对待测物特征结构的影响。所以，间隔臂一般第二章 甲砜霉素完全抗原的合成与鉴定为饱和链烃，常见的间隔臂如-(CH2)n-COOH，-(CH2)n-NH2等；间隔臂长度以4～6碳为宜[4]。

2.1.3 本章研究目的和主要研究内容

本章以BSA为载体蛋白，旨在合成TAP完全抗原，并对其完全抗原进行结构鉴定，获为建立快速准确检测TAP的ELISA免疫分析方法提供研究基础。本章的主要内容如下：

1）合成TAP羧基活化物并对其进行结构鉴定；

2）合成和纯化 TAP 完全抗原并对其进行结构鉴定。

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

牛血清蛋白(Bovine serum albumin, Fraction V)，卵清白蛋白(Ovalbumin)，批号030602，电泳纯，均购于上海伯奥生物科技公司；甲砜霉素(TAP)，浙江海翔药业有限公司；甲砜霉素(TAP)标准品 Sigma 公司；琥珀酸酐，化学纯；乙腈，色谱纯；三正丁胺，化学纯；氯甲酸异丁酯，化学纯；吡啶，分析纯。

无水吡啶：在 100mL 圆底蒸馏烧瓶中加入 50 mL 分析纯吡啶和 6g KOH，在冷凝回流装置下回流 2h，温度控制在 115℃，加入小块瓷片，防沸。然后放入装有分子筛的试剂瓶中密闭保存。

2.2.2 实验仪器

1）酸度计 DELTA 320-S 梅特勒-托利多（上海）

2）酶标仪 MK3 上海雷勃分析仪器公司

3）旋转蒸发仪 RE-52-2 上海亚荣生化仪器厂

4）冷冻干燥机 MicroMoDuLYo-230 美国电热公司

5）分析天平 AB104-N 梅特勒-托利多（上海）

6）HP$$lc-MS Agilent 1100 美国应用生物系统公司

7) 磁力搅拌器 90－2 上海沪西分析仪器厂

8）电泳仪和电泳槽 Bio-Rad 公司

9）紫外可见分光光度计 UV-2100 尤尼克仪器公司

2.2.3 实验方法

2.2.3.1 TAP 的酯化[5]

TAP 的酯化就是将甲砜霉素半琥珀酸酯(TAP-HS)化，在 TAP 分子上接上一个琥珀酸。

(1) 将 TAP、琥珀酸酐、乙腈、吡啶按 1﹕1﹕10﹕0.3 混合在一起, TAP 6 g, 琥珀酸酐 1.69 g, 乙腈 8mL 吡啶 0.45 mL,搅拌溶解，搅拌溶解,于 60 ℃回流 16 h，旋转蒸发，蒸去乙腈；

(2) 残留物用蒸馏水溶解，结晶，然后重结晶，得到白色晶体；

(3) 做 HP$$lc-MS 检测产物的合成情况。

2.2.3.2 TAP 完全抗原（TAP-HS-BSA）的合成

TAP 完全抗原的合成采用混合酸酐法[6]。

(1) 取 TAP-HS 200 mg，溶于 10 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，置 4℃下 l 0 min，加入三正丁胺 90μL，混合，再加入氯甲酸异丁酯 63 μL，于 4℃磁力搅拌 30m in，此为甲液；

(2) 与此同时,取 BSA 230mg，溶于 7 mL 50%DM F 中，在 4℃冰箱中溶解预冷，置冰浴上边搅拌边用 1 mol/L NaOH 调 pH 到 8.0，此为乙液。随后将乙液倾入甲液中，在 4 ℃下搅拌反应 4 h；

(3) 用灭菌的 0.85％NaCl 在 4 ℃下透析，每隔 8 小时一次，换水 16 次后冻干保存，得到完全抗原。

(4) 同法合成 TAP-HS- OVA 包被抗原,方法同上，只要把 BSA 换成 OVA 就可以了。

2.2.3.3 TAP 完全抗原的鉴定

（1）紫外分光光度计法[7]

用生理盐水精确配制 TAP、BSA 与 OVA 的标准溶液。称取一定量的偶联物溶于生理盐水中，按参考文献[7]中的 Bradford 法测其蛋白质的浓度。根据此浓度调整偶联物溶液中蛋白质的浓度使其与 BSA 一致。用 UV2100 紫外扫描仪，在波长为 200～300 nm的范围内分别进行扫描。根据文献[7]介绍的紫外分光光度法计算偶联率。

（2）SDS-PAGE 法

参照相关文献配制各种电泳缓冲液。浓缩胶浓度为 4%，分离胶浓度为 14%，电泳电压为 200v，用考马斯亮蓝染色。

（3）动物免疫实验

纯化完全抗原以后，合成的 TAP-BSA 能否刺激动物产生针对 TAP 分子的抗体只有通过动物实验来验证。动物免疫方案在第二章有所详细描述。
2.3 结果与讨论

2.3.1 TAP 完全抗原的构建原理

虽然TAP分子中含有两个羟基，考虑到TAP是一个小分子，直接与载体蛋白质反应生成完全抗原，由于大分子蛋白质的空间位位阻可能影响免疫系统对半抗原的识别，并且可能由于载体局部的微化学环境使半抗原结构发生“形变”，因此首先要通过适当的衍生化方法，将羧基基团引入TAP中，这样TAP分子末端连接一个羧基，就可以简单地借用合成肽的方法通过较稳定的酰胺键将半抗原与载体连接。构建TAP完全抗原的反应路线如图2-1所示。

首先是引入羧基基团。半抗原分子中与载体蛋白结合的位点的选择将影响到抗体免

疫特异性，选择半抗原结构类似物分子上共有的基团作为偶联点时，免疫动物产生的抗

体具有较好的特异性[3,8,9]。因此，本实验选择TAP分子中末端的C原子作为酯化点，将

末端碳原子上连接的羟基转化为COO-酯基羧酸。采用混合酸酐法，以吡啶为催化剂，

TAP在乙腈溶液中，通过回流加热，TAP转化为TAP羧基活化物。然后以氯甲酸异丁酯

作为缩合剂，TAP羧基酯化物与氯甲酸异丁酯形成活泼的酸酐中间物，羧基被酯化，在

碱性条件下与蛋白质的游离氨基反应生成酰胺键，形成稳定的偶联产物。

2.3.2 甲砜霉素半琥珀酸酯(TAP-HS)的结构鉴定

图2-2显示反应所得的产物甲砜霉素半琥珀酸酯与原来的甲砜霉素的结构式相比较。TAP起始化学组成为C12H15O5NCl2S，活化后的化学组成为C16H19O8Cl2S。活化后，分子量有所增加，而分子的特征结构未发生显著改变。

两种物质的出峰时间不一样，甲砜霉素是8.43 分，而生成的化合物是15.89分。图2-4显示的是TAP羧基活化物的电喷雾质谱图。m/z 454.8是TAP羧基活化物的准分子离子峰[TAP-HS]-由此算出，活化物的分子量为455.8，与应得产物C16H19O8Cl2S的分子量一致。综合HP$$lc和HP$$lc-MS的分析结果，可以初步断定活化产物即是TAP的酯化产物。

2.3.3 TAP-HS-BSA 偶联物鉴定

2.3.3.1 紫外分光光度计法

从图 2-5 可见，TAP 在波长 225nm BSA 在波长 280nm 吸收最大。BSA 在最大吸收波长的 A 值为 0.688，而此时 TAP-BSA 的 A 值为 0.368，TAP 的 A 值为 0.013。尽管TAP-BSA 溶液中蛋白质的浓度与 BSA 溶液相同，但 TAP-BSA 的 A 值却明显比 BSA的低。说明此时 TAP 与 BSA 已偶联形成 TAP-BSA。

2.3.3.2 载体蛋白 TAP 分子交联率的估算[9]

TAP-BSA交联物中蛋白质浓度的测定：经初步实验后，用PBS(0.01mol/L, pH7.2) 将TAP-BSA 稀释140×，TAP-OVA 稀释60×，紫外分光光度计测量260nm 和280nm 的分光光度值，根据如下公式：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45OD280nm-0.74OD260nm表 2-1 TAP-BSA 和TAP-OVA在260nm和280nm 的OD值Tab.2-1 The OD of TAP-BSA and TAP-OVA at 260nm and 280nm

偶联物 波长

260nm 280nm

TAP-BSA 0.266 0.395

TAP-OVA 0.249 0.342

经计算得：TAP-BSA：13.2mg/mL ；TAP-OVA：6.52mg/mL。

(1) 载体蛋白和 TAP 分子交联率的估算

将 TAP-BSA 溶液浓度调整为 250μg/mL，用 PBS(0.01mol/L, pH7.2)稀释甲砜霉素纯品(分子量 355.0048)、和 BSA(分子量 65000) ，配制浓度分别为 100μg/mL 和1100μg/mL 的溶液；然后用紫外分光光度计扫描(200nm～3000nm)。扫描结果如表 2-2。表 2-2. 最大吸收波长下，各溶液的吸光值

Tab. 2-2 The optical density of TAP、BSA and TAP-BSA at maximum absorb wavelength

样品 m.w. 浓度(mg/mL) A225 A280 最大吸收波长(nm)

TAP 355.0048 0. 1 1.750 0.013 225

BSA 68000 1.1 0.265 0.688 280

TAP-BSA 0.25 0.810 0.368 246

表 2-3 最大吸收波长下，各溶液的吸光值

Tab.2-3 The optical density of TAP、OVA and TAP-OVA at maximum absorb wavelength

样品 m.w. 浓度(mg/mL) A225 A280 最大吸收波长(nm)

TAP 355.0048 0. 1 1.75 0.013 225

OVA 45000 0.90 0.236 0.623 280

TAP-OVA 0.15 0.685 0.351 249(2) 根据表 2-2 中半抗原 TAP 的最大吸收波长下的数据估算两者的交联率

根据大分子与小分子偶联前有各自不同的紫外吸收峰，偶联后表现出紫外吸收峰偏移的性质，根据公式K=A/CL 分别求出两物质在两波长处的摩尔吸光系数，再由公式Ca/Cb=(AC am·KBbm-ACbm·KBam)/(ACbm·KAam-ACam·KAbm) 即可求出两物质摩尔浓度比值。（其中KAam与KBbm分别表示A、B 两物质在A 物质、B 物质最大吸收峰波长处的摩尔吸光系数，KAbm 与KBam分别表示物质A 在物质B 的最大吸收峰波长处摩尔吸光系数、物质B 在物质A 的最大吸收峰波长处的摩尔吸光系数，ACam和ACbm为吸光值或光密度值，即OD 值，C 为浓度，L 为光程，脚标 a, b 表示物质a 和物质b，脚标 m表示最大吸收波长）。

定点检测适当稀释后的 TAP-BSA 在相应TAP 和BSA 最大波长处的光吸收值，由公式Ca/Cb=(ACam·KBbm-ACbm·KBam)/(ACbm·KAam-ACam·KAbm) 即可求出两物质克分子浓度比值。经过计算，TAP与载体蛋白的偶联比为1﹕12.5 ，同法测得的TAP与OVA的偶联比为1:7.8 。结合抗原鉴定的的一个基本方面是确认半抗原与载 体蛋白的的连接和测定结合比。一般认为，半抗原结合比过高或过低均影响抗体的产生，以5～15 为宜。但是一些实验结果表明，半抗原的结合比的大小对诱导抗体产生并无决定性的影响，每分子蛋白质只连接一个半抗原也可以产生特异性抗体，并且低结合比可能有助于提高抗体的选择性和亲和力。本实验的完全抗原结合比为1﹕12.5，可以诱导产生抗体。TAP与OVA偶联，合比为1:7.8作为包被抗原。

2.3.3.3 TAP-BSA 的 SDS-PAGE 分析

在透析结束以后，进行了 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳实验，结果见图 2-6。图 2-6 TAP-BSA 的 SDS-PAGE 图

Fig.2-6. The SDS-polyacrylamide gel electrophoresis figure 1.marker；2.TAP-BSA；3.BSA

diluted by 1:32

从电泳图的泳道 2 可以看出，TAP-BSA 的电泳条带明显滞后于载体蛋白质BSA 的电泳条带，由于电泳样品 BSA 和 TAP-BSA 的蛋白质含量相同，因此可以推知 TAP-BSA 的相对分子质量(Mr×103)大于 BSA 的相对分子质量，也即 TAP 已与 BSA 结合形成 TAP-BSA。从图中也可以看出，纯化后的产物也是一条谱带，说明纯化的偶联产物达到一定的纯度。2.3.3.4 动物免疫实验

虽然，从实验反应过程中的现象，紫外扫描实验和电泳实验可初步推知 TAP分子确实已经结合到 BSA 分子上了，但合成的 TAP-BSA 能否刺激动物产生针对TAP 分子的抗体只有通过动物实验来验证。

对免疫所得到抗血清进行双向免疫扩散法检测，从图 2-7 可以看到，抗血清既可以和 TAP-BSA 与 BSA 反应形成可见的沉淀线，也可以与 TAP 和 TAP-OVA 反应形成可见的沉淀线，而不与 PBS 及 OVA 反应形成可见的沉淀线，可以推知抗血清中不仅含有针对 BSA 的抗体，同时，也含有针对 TAP 的抗体。从而说明完全抗原合成成功。

图 2-7. 抗血清双向免疫扩散图

Fig.2-7 Double direction immunodiffusion

1. PBS；2. BSA； 3. TAP-BSA； 4. OVA ；5. TAP-OVA； 6.TAP；Middle core:

antiserum diluted by 1:32
2.3.3.5 TAP 酯化分析

虽然 TAP 分子中含有羟基，但是 TAP 分子的空间结构复杂，如果直接和蛋白质偶联，有可能改变蛋白质的构象，使得免疫动物不能识别 TAP 分子，得不到抗体。因此有必要延长碳链。这样在不改变 TAP 分子结构的情况下，很好的和蛋白质结合。在合成 TAP 酯化产物的过程中，TAP 要过量，这样可以减少副产物，在反应过程中，要保持干燥的环境。实验中发现，如果有水分存在，几乎不能到想要的产物。

2.4 本章小结

1. 通过酯化反应，合成了 TAP 酯化产物，HP$$lc/MS 鉴定结果表明，获得产物就是应得的 TAP 酯化产物；

2. 利用混合酸酐法合成 TAP-BSA 偶联物，构建 TAP 完全抗原并进行鉴定。起始的摩尔比和合适的反应溶剂系统是提高偶联比和 TAP-HS 利用率的主要因素。本实验起始的摩尔比为 TAP-HS：载体蛋白 BSA 为 50︰1，采用二甲基甲酰胺 DMF 和 PBS（pH8.0） 溶液混合系统，所得偶联产物的偶联比为 1︰12.5 ；

3. 通过紫外扫描，在同样的浓度下，TAP-BSA 的吸收值比 BSA 低，说明偶联物有可能合成成功，在 SDS-PAGE 分析中，TAP-BSA 明显滞后 BSA，说明了蛋白质的结构有了变化，最后通过动物实验，得到了抗 TAP 的抗血清，三者联合验证了偶联物是合成成功的。第二章 甲砜霉素完全抗原的合成与鉴定
第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

3.1 引言

3.1.1 多抗的制备原则

许多动物，如家兔、豚鼠、山羊、绵羊和小鼠等均能产生高亲和力的半抗原抗体。由于免疫测定只需要极少抗体(1 mL抗血清足以供数千次免疫测定使用)，因此对研究者而言，家兔是较合适的动物。家兔的饲养和操作方便，1只兔可采集近百毫升全血，能分离30～40 mL血清。家兔抗体中的IgG含量高，抗体比较均一。

半抗原一般为单价反应，因此对抗体的质量(亲和性和选择性)要求很高。根据抗体产生的动力学，相同抗原重复免疫是获得高效价抗血清所必需的。半抗原抗体，特别是高性能抗体的产生速度较慢。小剂量、低频率和长时间(10周以上)免疫注射应作为制备半抗原抗体的基本原则。

对于免疫程序，通常使用免疫佐剂将抗原制成油包水乳剂，以增强免疫原性、延长抗原作用时间和保护抗原不被破坏。首次免疫使用弗氏完全佐剂(Freurnd's completeadjuvant，含分枝杆菌死苗)，剂量为 0.1～1.0 mg/kg 体重，皮内多点注射；此后每隔 3～4 周加强免疫一次，免疫后期间隔适当延长，并且自第 3 次免疫后开始检查抗体效价(免疫注射后第 7～10 天)；一般持续免疫 8～12 周(免疫 3～5 次)后抗血清才可能达到较高的效价；最后一次加强免疫时剂量加倍，将纯抗原经肌肉或静脉注射方式免疫，第 7～10 天采血制备抗血清

3.1.2 本章研究目的和主要研究内容

本章通过动物免疫，获得抗 TAP 的多克隆抗体，并且对所获得的多抗进行纯化和鉴定。

1）将上章得到的完全抗原免疫兔子，获得含有抗体的血清；

2）将血清分离纯化得到多抗；

3）对多抗进行鉴定。第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

TAP-BSA，TAP-OVA偶联物用第二章方法制备。弗氏完全佐剂、弗氏完不全佐剂、吐温20(Tween 20)、聚乙二醇(PEG，MW1000)、四甲基联苯胺(TMB) 进口分装、羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)、邻苯二胺(OPD)均购于上海华美公司；新西兰长耳白兔(1.5-2kg)，无锡山禾药业实验动物中心； 聚苯乙烯酶联微孔板，Corning公司；甲砜霉素(TAP)、土霉素、氯霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、红霉素、青霉素，这些药品均购自于sigma公司。

3.2.2 实验仪器

（1）冷冻干燥箱 E255Q 美国 FTS 公司

（2）酶标仪 MuLtiska Mks Thermo Labsystems 公司

（3）台式低速离心机 TGL－40B 上海安亭科学仪器厂

（4）电脑采集器 HD-A 南京大学仪器厂

（5）自动部分收集器 BSZ-100 上海精科实业有限公司

（6）恒流泵 HL-2B 上海精科实业有限公司

3.2.3 实验方法

3.2.3.1 抗体纯化

1. 饱和硫酸铵沉淀法

(1) 饱和硫酸铵溶液：取 500mL 蒸馏水，加热至 70～80℃，将 400g 硫酸铵溶于水中， 搅拌 20min，冷却。硫酸铵结晶沉于烧杯底部，上清即饱和硫酸铵。再用 28%氨水将饱和硫酸铵调节为 pH7.0。

(2) 0.0175mol/L pH6.4 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 ： NaH2PO4 · 2H2O 40.15g ；Na2HPO4·12H2O 33.22g，加蒸馏水至 2000mL,用时稀释 10 倍。

(3) 奈氏试剂：称碘化汞 115g，碘化钾 80g 加入不含氨的蒸馏水 500mL，溶解后过滤，滤液中加入 20%NaOH 500mL

2. DEAE 柱层析法

DEAE 纤维素的处理

(1) 浸泡：取 DE-23 100g，加蒸馏水浸泡过夜，弃上清，加蒸馏水缓慢搅匀，浸泡 3 小时后，弃上清，加蒸馏水，如此反复洗泡 8 次，尽量弃去其中的碎末。最后，弃上清加少量蒸馏水，搅匀成糊状。

(2) 碱处理：将糊状物移入玻璃漏斗中，抽滤干后，倒入烧杯中，加 0.5mol/LNaOH 1500mL，轻轻的搅匀，置室温 40～60min，每 10min 搅拌 1 次。倾去上清液，再移入玻璃漏斗中，反复用蒸馏水洗滤至中性。

(3) 酸处理：碱处理后倒入烧杯中,加入 0.5mol/L HCl 1500mL,轻轻的搅匀，置室温 40～50min，每 10min 搅匀一次，弃上清后移入玻璃漏斗中，加蒸馏水反复滤洗至中性。重复碱处理。

(4) 泡洗：用蒸馏水浸泡 2d，期间换水 5 次。

(5) 平衡：用 0.0175 mol/L，pH6.4 磷酸盐缓冲液浸泡，每 15min 换液 1 次，直至洗出液的 pH 为 6.4 为止，可准备上柱。

3. 免疫亲和层析法

CNBr 活化的琼脂糖颗粒的处理主要依照 Amersham Biosciences 公司的说明书进行。

(1) 溶胀：称取 10gcNBr-Sepharose CL-4B 干粉慢慢倒入装有一定 1mmol/L

HCl 的洁净烧杯中，在 4℃溶胀 15min。

(2) 洗涤：在 G3 烧结玻璃漏斗上，用大约 2000mL 1mmol/L 的 HCl 反复洗

涤溶胀的 CNBr-Sepharose CL-4B。

(3) 交联缓冲液：0.1mol/L,pH8.3 的 NaHCO3 溶液，含 0.5mol/L 的 NaCl。

(4) 封闭缓冲液：1mol/L，pH8.0 的乙醇胺溶液。

(5) 醋酸缓冲液：pH4.0，0.1mol/L，含 0.5mol/L NaCl。

(6) Tris-HCl 缓冲液：pH8.0，0.1mol/L，含 0.5mol/L NaCl。

3.2.3.2 抗体鉴定

1. 免疫扩散法

15g/L 琼脂凝胶：100mL，pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到 1.5g 的琼脂内，水浴加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到 65℃左右时，加入0.1g 叠氮钠(NaN3)，使其于溶液中的浓度为 0.1%。
2. ELISA 法

(1)10×包被缓冲液(0.1mol/L，pH9.6 的碳酸盐缓冲液)

0.1mol/LNa2CO3 贮液：10.6g Na2CO3，三蒸水定容至 1000mL；

0.1mol/L NaHCO3 贮液：8.4g NaHCO3；三蒸水定容至 1000mL；

0.1mol/L Na2CO3 贮液 300mL 和 0.1mol/L NaHCO3 贮液 700mL 混合即可。

(2) 0.01mol/L ，pH7.4 磷酸缓冲液(PBS)NaCl 40g

KCl 1gKH2PO4 1gNa2HPO4·12H2O 18.1g三蒸水 300mL加热至 40℃，全部溶解后，冷却至室温，定容至 500mL，用时稀释 10 倍。

(3) 洗涤缓冲液(PBST)：含 0.05％Tween-20 的 0.01mol/L ，pH7.4 PBS。

(4) 封闭缓冲液：2g 卵清蛋白，用一定量 0.01 mol/mL ，pH7.4 的 PBS 溶液溶解，定容至 100mL，用纱布过滤。一般现配。

(5) 抗体稀释液：3g 白明胶，加入一定量的 0.2mol/mL ，pH8.5 的 PBST 溶液中，加热至 40℃，不断搅拌，全部溶解后，冷却至室温，定容至 1000mL。

(6) 显色液 1：A 液(0.01mol/L Na2HPO4)：17.8g Na2HPO4·12H2O，800mL 双蒸水溶解后，30% H2O2 20μL，定容至 1000mL，保存备用；B 液(0.1mol/L 柠檬酸－OPD)：柠檬酸 21.0g，OPD1.2g，双蒸水加至 1000mL。使用时，A 液与B 液等量混合均匀即可。

(7) 显色液 2： A 液：0.2mol/L Na2HPO425.7mL，0.1mol/L 柠檬酸 24.3mL，33μL30% H2O2，加蒸馏水至 100mL；B 液:10mgTMB 溶于 10mL 乙二醇。用时，10mL A 液与 0.4mL B 液混合即可。

(8) 2mol/L 的 H2SO4 终止液：三蒸水 177.8mL，慢慢滴入 98%的浓硫酸 22.2mL。

3.2.3.3 抗 TAP 抗体的制备[1-7]

1) 选择健康雄性 2 月龄新西兰白兔(体重 2～2.5kg)3 只，耳缘静脉采血，作为阴性对照；

2) 用生理盐水配制 TAP-BSA 溶液，用 Braford 法测定 TAP-BSA 中的浓度，并调整为 2mg/mL，分成 6 管，1mL/管，为免疫一次之用量。

3) 乳化：取 1 管上述 TAP-BSA 溶液，与完全或不完全佐剂 1mL 混合，用注射器反复抽拉，直至抽拉困难，滴至水面上 10min 不散开，即表示乳化成功。

4) 免疫：免疫程序按下表 3-1 进行。

表 3-1 免疫方案

Tab.3-1 The method of immunization

免疫次数 免疫原 免疫剂量 免疫部位

第一次 免疫抗原加入等量弗氏完全佐剂 1.0mL 后脚趾间隙

第二次 免疫抗原加入等量弗氏不完全佐剂 1.0mL 后腿股淋巴结

第三次 同上 1.0mL 背部皮下三点注射

第四次 同上 1.0mL 背部皮下三点注射

第五次 同上 1.0mL 背部皮下三点注射

第六次 免疫抗原 1.0mL 后腿肌肉注射

第六次免疫一周后，在颈动脉采全血，置于塑料离心管。

3.2.3.4 抗血清分离

塑料离心管倾斜 50 度，静置于室温 4h，待血液凝固后，于 4℃冰箱中过夜，血清自然析出，将血清吸出，于 3000 r/min 离心 15min，取上清加入硫柳汞混匀，分装后于4℃冰箱中保存。

3.2.3.5 抗血清纯化

1. 饱和硫酸铵盐析法

(1) 盐析：取免疫兔血清 100mL，加入等量生理盐水，摇匀后，缓慢加入饱和硫酸铵溶液 200mL，边加边摇匀，充分混合后置 4℃冰箱内半小时以上。取出后离心，5000 r/min，20min。弃去上清液，加入生理盐水 100mL，溶解沉淀物后，加入 50mL 饱和硫酸铵，使硫酸铵的饱和度达 33％，边加边摇匀，充分混匀，置 4℃冰箱内 40min。取出后离心沉淀，以 33％饱和度硫酸铵重复二次盐析。

(2) 脱盐：将离心后的上清液弃去，用少量生理盐水将沉淀物溶解，使其达到原血清量的 1/4 左右，装入透析袋中。以 0.0175mol/L pH6.4 磷酸盐缓冲液，4℃冰箱中透析 3 天，每天换液数次，每次 2000mL。后期用奈氏试剂测 NH4+，直至用奈氏试剂测不出铵离子为止，此时为粗提的 IgG。2. DEAE-纤维素离子交换法

取装好的 DEAE 层析柱，用 pH6.4 的 PBS 液洗柱 1h，维持柱体积不变后，吸取上端 PBS 液，留下约 2mm 高的 PBS 液。粗提的 IgG 先离心，2000 r/min，10min，取上清液沿柱壁四周缓慢加入柱中，添加 2mL 离心后粗提的 IgG。打开柱下端口，流出一些液体，使样品慢慢进入柱床。待样品全部入柱时，添加少量 PBS，留少量 PBS 液于柱顶，关闭下端出口。静置 30min，加 PBS 于柱上，保持 PBS 液面在柱床以上，打开下端出口，调节流速至 20 滴/min，用收集管收集洗脱液。吸取少许洗脱液，用 20％磺基水杨酸钠测定是否已出现蛋白质，并用紫外分光光度计测 OD 值，将 OD 值高的各管洗出液合并，装入透析袋，用 30％的 PEG 浓缩透析液，可获得所需浓度的提纯 IgG。SDS-PAGE 法检测提纯效果。

3. 免疫亲和层析法[8,9]

(1) 称取 50mgBSA，溶于 10mL 交联缓冲液中。同时测 OD280。

(2) 用大约 2L 交联缓冲液，在 G3 玻璃漏斗中快速洗涤处理好的凝胶，洗涤后立即与 BSA 溶液混合。在摇床上，室温摇动 1h。

(3) 1000r/min 离心 5min，测上清液的 OD280，按下面的公式计算交联率：交联率＝(上样前的 OD280－上清液的 OD280)/上样前的 OD280

(4) 用大约 10L 交联缓冲液，反复洗涤凝胶。

(5) 将凝胶转移至封闭缓冲溶液中，在摇床上，室温摇动 2h。

(6) 用醋酸缓冲液和 Tric-HCl 交替洗涤凝胶 4 次。

(7) 洗涤好的凝胶上柱，用 100mL 交联缓冲液平衡亲和柱。第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

(8) DEAE 纯化抗血清在交联缓冲液中透析 2h。取 3mL 上样，用交联缓冲液洗脱，流速 1mL/min，通过紫外检测仪检测，至基线平稳为止。

(9) 洗脱液于 4℃，pH7.4 的 PBS 缓冲液中透析 2d，多次换液。冷冻干燥浓缩后与等量甘油混合，分装，-20℃储存。间接 ELISA 法检测提纯效果。

（10）解吸附：用 pH2.8，0.2mol/L 的甘氨酸－盐酸缓冲液洗脱。

（11）层析柱再生：用100mL，0.1mol/L，pH8.5的Tris-HCl(含0.5 mol/L NaCl)和100mL，0.1mol/L，pH4.5 的醋酸钠缓冲液(含 0.5 mol/L NaCl)，交替洗涤 3 次。再用交联缓冲液平衡(含 0.02%的 NaN3)，4℃冰箱储存。

3.2.3.6 抗血清的鉴定

1. 琼脂双向免疫扩散法[10]

(1) 浇板：用 5～10mL 吸管吸取溶化的 15g/L 的琼脂凝胶，于一张洁净载玻片的后1/3 处浇注，约 3mm 厚，使琼脂凝胶均匀布满玻片，不能有气泡。

(2) 打孔：待凝胶凝固后，用打孔器打孔。

(3) 加样：一块玻片的中央孔内加入 1︰32 稀释的阳性抗血清，另一玻片的中央孔内加入同样稀释的阴性抗血清，周边 6 孔分别添加 TAP-OVA，TAP，TAP-BSA、BSA，OVA，PBS。

2. SDS-PAGE 法检测 DEAE-纤维素纯化效果浓缩胶浓度为 4%，分离胶为 12%，200v 恒压，开始电流 100mA，终止电流 60mA，45min 走完。考马斯亮蓝染色 30min，脱色 1h。3. 间接 ELISA 法检测亲和层析效果

(1) 0.2g/L 的 BSA 溶液(包被缓冲液溶解)包被 96 孔酶标板，100μL/孔，4℃冰箱过夜。次日，从冰箱内取出，室温回温 30min，每孔注入 200μL PBST，在摇床上振荡 3min 后，用力甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干，继续洗涤 2 次。下面的洗涤方法相同。

(2) 充分洗涤后，用 20g/L 的 OVA 溶液封闭酶标板，200μL/孔，37℃ 2h。

(3) 取 6 条酶标板条，第 1 行加抗体稀释液作为空白对照；第 2 行加 1:1 000 稀释的阴性血清；3 条板条加入 1︰40000、1︰80000 稀释的过 DEAE 柱但未过亲和柱的抗血清(DEAE-Ab)，另 3 个板条加入 1:10000、1:20000 过免疫亲和层析柱的抗血清(IA-Ab)，100μL/孔，每个浓度均为 9 个平行孔。

(4) 依次加入 HRP-IgG 和显色液 1，均为 100μL/孔，每一步均经过洗涤和温育。

(5) 最后，用 2mol/L H2SO4 终止反应，于波长 450nm 测定吸光度(OD)值。

4. 抗体含量的测定

分别将亲和层析纯化血清稀释至适当的浓度，分别测 260nm 和 280nm 的吸光度，按公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度(mg/mL)=1.45 OD280nm－0.74 OD260nm

5. 抗体亲合常数的测定(间接非竞争 ELISA 法)[11-15]

(1) 包被缓冲液将 TAP-OVA 溶液按 1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/1600、1/3200、1/3200、1/6400、1/12800 的比例稀释后，100μL/孔包被 96 孔酶标板，4℃冰箱过夜。(2) 洗涤封闭后，加入系列稀释的已知浓度的过亲和层析柱的抗体，100μL/孔，每个浓度设 3 个平行孔，37℃温育箱内 2h，同时设空白对照孔。

(3) 按前面介绍的方法加 HRP-IgG 、显色液 1、终止液及测定。

(4) 以抗体浓度的对数为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，每个包被浓度均可作一条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的 OD 值为 100%，查出各曲线 OD 值为 50%所对应的抗体浓度[Ab]t, [Ab]′t，[Ab]″t，[Ab]″＇t，根据公式 Ka=(n-1)/2(n[Ab]′t－[Ab]t)，

3 个 Ka 值的平均值为抗体的亲和常数。

6. 间接 ELISA 法测定抗血清效价

用包被抗原 TAP-OVA 交联物包被酶标板，用 PBS 稀释抗血清及酶标二抗，进行间接 ELISA 。抗血清按 1︰100、1︰1000、1︰10000 … … 倍比稀释，每个浓度设两个平行孔，利用阳性－阴性比率(P/N)法进行判断，以 P/N>2.1 为阳性。为避免阴性血清大比例稀释后吸光值过低，使测定比值无实际意义，阴性血清以 1:1000 稀释。

操作步骤

（1）将抗原用包被液稀释成适当浓度，以每孔 100μL 的量加入酶联反应板中；

（2）放入 37℃温箱中 2h 或 4℃冰箱中过夜，取出后倒掉余液并用 200μL/孔的洗液洗板三次，间隔每次 3min，之后拍干；

（3）每孔加入 200μL 的封闭液放入 37℃温箱 2h，取出后直接拍干；

（4）每孔加入 100μL 稀释血清，放入 37℃温箱 30min，取出后洗涤同上，拍干；

（5）每孔加入 100μL 的一定浓度的酶标二抗(说明书推荐浓度)，放入 37 ℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；

（6）每孔加入 TMB 溶液 100μL，之后放入 37℃温箱 15min，取出后每孔加入 100μL终止液，并用酶标仪中测定光密度（optical density, OD）值。

（7）测定 OD 值。

以上每一步均经 PBST 溶液洗涤 3 次，3min/次。以 OD450为纵坐标，抗体稀释倍数的负对数为横坐标作图，当 OD 值大于或等于阴性对照孔的 2.1 倍（即 P/N≧2.1）并且OD 值大于 0.2，此时血清的稀释倍数为血清的效价。

7. 抗体特异性的鉴定

方法同上 6，但抗体抑制物分别采用甲砜霉素（TAP）、土霉素、氯霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、红霉素、青霉素进行竞争 ELISA。

根据下列公式计算交叉反应率：

交叉反应率（%）= 引起 50%抑制的 TAP 的浓度/引起 50%抑制的类似物的浓度×100
3.3 结果与讨论

3.3.1 抗体纯化分析

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质，此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可以利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白变性而应用最广。DEAE-纤维素阴离子交换法是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸铵沉淀法联合使用可以非常有效的纯化抗体。DEAE 是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过 DEAE 柱时，带负电荷的蛋白质可以被 DEAE 吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出，纯化抗体时刻选择 pH 值大于待纯化抗体等电点的缓冲液，此时抗体带负电荷，使之吸附在 DEAE上面，然后用增加盐度的方法将抗体洗脱。经过两次处理的抗体，还含有抗 BSA 的抗体，此时可以选择通用免疫亲和层析法除去抗 BSA 的抗体，得到单一的抗 TAP 的抗体。

3.3.1.1 双向免疫扩散法检测结果分析

从图 3-1 可以看到，抗血清既可以和 TAP-BSA 与 BSA 反应形成可见的沉淀线，也可以与 TAP 和 TAP-OVA 反应形成可见的沉淀线，而不与 PBS 及 OVA 反应形成可见的沉淀线，可以推知抗血清中不仅含有针对 BSA 的抗体，同时，也含有针对 TAP 的抗体。

图 3-1. 抗血清的双向免疫扩散图

Fig.3-1 Double direction immunodiffusion 1.PBS ;2.BSA; 3.TAP-BSA; 4.OVA ;5.TAP-OVA; 6.TAP；

Middle core: antiserum diluted by 1:32

3.3.1.2 DEAE-纤维素纯化抗体结果分析

图 3-2 的 SDS－PAGE 图中，1、2 泳道的样品分别为经过饱和硫酸铵沉淀未经 DEAE柱的抗血清和经过 DEAE 柱的抗血清。从图中可以看到，未经 DEAE 柱的抗血清电泳出现多条蛋白条带，说明经过盐析后的抗血清中杂蛋白仍然比较多。而经过 DEAE 柱层析的抗血清电泳仅出现 1 条条带，参照相关文献，此条带应该为集中的免疫球蛋白。

也说明 DEAE 柱层析纯化抗体取得预期的效果。但是纯化后的抗血清中仍然含有针对BSA 的抗体，为了得到单一特异性的抗体，必须经过亲和层析柱，将抗 BSA 的抗体结合在柱上。

图 3-2 抗血清的 SDS－PAGE

Fig.3-2 The SDS－PAGE of serum

3.3.1.3 间接 ELISA 法检测亲和层析纯化抗体结果分析

表 3-2 间接 ELISA 法检测纯化抗体

Tab. 3-2 The result of purified antibody by ci-ELISA

血清

类型

空白

血清 阴性血清 未经亲和柱的血清 经过亲和层析的血清

稀释度 未稀释 1﹕1000 1﹕40000 1﹕80000 1﹕10000 1﹕20000

吸光度 0.101 0.235 2.563 2.498 0.302 0.285

从表 3-2 可以看到，虽然经过亲和层析的血清稀释倍数比未经亲和层析的血清稀释倍数小，但其吸光度却远小于未经亲和层析抗体的吸光度，与阴性血清的吸光度相差无几，说明抗血清中针对 BSA 的大 部分抗体被吸附到亲和层析柱上，也即收集的过亲和层析柱的抗血清为针对 TAP 的单一特异性的抗体3.3.1.4 抗体亲和常数测定结果分析

抗体稀释倍数[log(1/[Ab])]

光吸值度Ag1 Ag2 Ag3

图 3-3 亲和常数测定图

Fig.3-3 Determination of affinity constant by indirect ELISA第三章 多克隆抗体的制备纯化与鉴定

45

用紫外分光光度计测得抗体在 280nm 和 260nm 波长处的吸光度分别为 2.853 和

2.604，用公式计算即得抗体浓度为 2.21mg/mL。抗体分子量以 1.6×105 计算。从图 3-3

可以查得不同包被浓度下，对应 OD50%时抗体的浓度，根据抗体亲和常数计算公式可求得 TAP 抗体的平均亲和常数为 7.8×10-9mol/L。

3.3.1.5 间接 ELISA 法测定抗血清效价结果分析

表 3-3 血清效价测定

Tab.3-3 ELISA titers of serum

血清稀释倍数 阴性 空白

102 105 106 107 108 109 103

吸光度 2.635 2.602 1.621 0.286 0.086 0.062 0.232 0.065

表 3-3 为抗体稀释倍数的对数对相应吸光度的值。1:1000 稀释的阴性血清平均 OD值为 0.23 左右。阳性血清稀释到 106倍时，此时 OD 值与于阴性血清的 OD 值之比为 7，当此比值大于 2.1（即 P/N≧2.1）并且 OD 值大于 0.2，此时血清的稀释倍数为血清的效价。所以抗体的效价大概为 1×106 以上。抗体效价的测定随测定条件和判定标准的不同而不同。

3.3.1.6 抗体特异性分析

采用间接 ELISA 测定方法，根据公式计算的到抗体和 TAP 结构类似物的价差反应率，结果显示出与氯霉素少有交叉反应之外，与其他化合物并无反应。说明抗体的特应良好。

结果见表 3-4。

表3-4 抗体与其它抗生素的交叉反应率

Tab. 3-4 Cross-reactivity of TAP antiserum with other antibiotics

抗生素 交叉反应率%

氯霉素 0.4

泰乐菌素 <0.01

链霉素 <0.01

四环素 <0.01

土霉素 <0.01

青霉素 <0.01

红霉素 <0.01

庆大霉素 <0.01

新霉素 <0.01

卡那霉素 <0.01

3.4 本章小结

1. 通过免疫兔子，制备得到了抗 TAP 的特异性抗体，并且通过饱和硫酸铵沉淀，DEAE柱层析和免疫亲和层析法对抗体进行了纯化。

2. 通过 ci-ELISA 方法对抗体的效价，亲和常数和特异性进行了鉴定。抗体的效价达到了 1×106以上，亲和常数为 7.8×10-9mol/L。抗体除与氯霉素有轻微的交叉反应外，无明显交叉反应第四章 ELISA 方法的建立与优化

4.1 引言

4.1.1 免疫分析简介

免疫分析(immunoanalysis)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。免疫反应涉及抗原与抗体分子间高度互补的立体化学、静电、氢键范德华力和疏水区域的综合作用，因而具有单独任何 一种理化分析技术难以达到的选择性和灵敏度,非常适用于复杂基质中痕量组分的分离和检测。 兽药残留免疫分析方法的建立包括以下方面的内容：待测物选择、免疫半抗原合成、结合抗原合成、抗体制备、测定方法、样本前处理方法和方法评价。根据半抗原载体现象合成结合抗原、制备抗体和建立免疫分析方法已成为各种小分子免疫分析的基本模式。酶联免疫吸附测定法(ELISA)是当前应用最广、发展最快的固相酶免疫测定技术。一般将抗原或抗体吸附于固相载体进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度法进行检测。国内外已有ELISA专用的比色计(酶联免疫检测仪)出售，高档仪器带有曲线拟合等数据处理软件，使用方便。

4.1.2 本章研究目的和主要内容

通过前几章的研究，得到了高特异性的抗体。本章根据 ELISA 原理，建立 TAP 的快速检测方法。主要研究内容：

1） ELISA 检测方法的建立；

2） ELISA 检测方法的优化。

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

TAP-BSA，TAP-OVA 偶联物用第二章方法制备。抗体用第三章方法制备。 聚苯乙烯酶联微孔板，Corning 公司；吐温 20(Tween -20)、聚乙二醇(PEG，MW1000)、四甲基联苯胺(TMB) 进口分装、羊抗兔IgG、HRP标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)、邻苯二胺(OPD)均购于上海华美公司。新鲜鱼，购于青山菜市场。

4.2.3 主要仪器

（1）冷冻干燥箱 E255Q 美国 FTS 公司

（2）酶标仪 MuLtiska Mks Thermo Labsystems 公司

（3）台式低速离心机 TGL－40B 上海安亭科学仪器厂

（4）分析天平 AB104-N 梅特勒-托利多（上海）

（5）酸度计 DELTA320-S 梅特勒-托利多（上海）

4.2.4 主要溶液

1) 包被缓冲液 (0.05mol/L，pH9.6)

Na2CO3 1.59g

NaHCO3 2.93g

加蒸馏水至1000mL

2) 封闭液

卵清蛋白(OVA) 2.00g

包被缓冲液 100mL

3) 洗涤液 (0.01 mol/L，pH7.4)

NaCl 8.00g

KCl 0.20g

KH2PO4 0.20g

Na2HPO4·12H2O 2.9g

Tween-20 0.5mL

加蒸馏水至1000mL

4) 稀释液

明胶 0.10g

洗涤液 100mL

5) 终止液 (2 mol/L H2SO4)

浓硫酸（98%） 22.2mL

蒸馏水 177.8mL

6) 底物缓冲液

Na2HPO4·12H2O 9.2g

柠檬酸 2.55g

加蒸馏水至500mL

7) TMB底物测定液

TMB储存液(4.2mg溶于10mL乙二醇)2mL，底物缓冲液10mL，30% H2O2 1.9μL。临用时新鲜配制。

8) PBS (0.2 mol/L，pH6.7)

Na2HPO4·12H2O 3.12g

NaH2PO4·2H2O 1.76g

加水至100mL

9) PBS (0.0175 mol/L，pH7.0)

87.5mL PBS（1.1.4.8），加水定容至1000mL。

10) 显色液 1：A 液(0.01mol/L Na2HPO4)：17.8g Na2HPO4·12H2O，800mL 双蒸水溶解后，30% H2O2 20μL，定容至 1000mL，保存备用；B 液(0.1mol/L 柠檬酸－OPD)：柠檬酸 21.0g，OPD1.2g，双蒸水加至 1000mL。使用时，A 液与 B 液等量混合均匀即可。

11) 显色液 2: A 液：0.2mol/L Na2HPO425.7mL，0.1mol/L 柠檬酸 24.3mL，33μL 30%H2O2，加蒸馏水至 100mL；B 液：10mgTMB 溶于 10mL 乙二醇。用时，10mL A液与 0.4mL B 液混合即可
4.3 实验方法

4.3.1 ELISA 方法的建立

4.3.1.1 酶标板的选择[1-3]

以下测定的显色液均为显色液 2，抗体均为 Ig-Ab 抗体。

各种板的性能的检测(粗筛)

(1) 包被：随机抽取进口板和国产板各两块，用 pH9.6，0.01mol/L 的碳酸盐缓冲液1:1000 稀释的羊抗兔 IgG 包被，100μL/孔。4℃冰箱过夜。

(2) 洗涤：次日将板从冰箱中取出，回至室温，弃去孔内的液体，用 8 道移液器添加洗涤缓冲液 200μL/孔，在摇床上振荡 3min，再弃去孔内的液体，在吸水纸上

用力拍干；同法洗涤 3 次。

(3) 封闭：每孔加 200μL 封闭液，室温(Room Temperature 室温)温育 2h 后，洗涤，拍干。

(4) 加酶标二抗：用抗体稀释液将 HRP-IgG 按 1:1000 稀释，100μL/孔，37℃湿盒温育 30min，同上法洗涤，拍干。

(5) 加显色液，100μL/孔，室温温育 15min。

(6) 显色测定：加终止液 100μL/孔，终止反应后，在酶标仪上测 OD450 值。

计算同一板的孔间变异系数（CV）和板与板之间的 CV。孔间 CV 应小于 5%。板间差异采用 t 检验来评价，同时参考价格因素和来源等因素来决定板的取舍。

4.3.1.2 HRP－IgG 工作浓度和显色液中 H2O2 浓度的确定

(1) 包被：用 pH9.6，0.01mol/L 的碳酸盐缓冲液 1﹕1000 稀释羊抗兔 IgG，100μL/孔包被，4℃冰箱过夜。

(2) 按 1﹕500，1﹕1000，1﹕2000，1﹕3000，1﹕4000 的比例稀释 HRP-IgG，100μL/孔，每个浓度 2 列 16 个孔，室温温育 30min。第 1 列及 12 列加抗体稀释液，为空白对照。

(3) 添加 H2O2 浓度分别为 0.1%，0.05%、0.01%、0.005%的显色液，100μL/孔，每个浓度 2 行 24 孔。选择室温 20min，吸光度在 1.2 左右的稀释浓度为 HRP-IgG的工作浓度，此时 H2O2的浓度为显色液中 H2O2的工作浓度。

4.3.1.3 包被抗原、一抗的工作浓度的确定[4]

(1) 包被：用包被缓冲液将包被抗原 TAP-OVA 系列稀释(1﹕1000~1﹕8000)，包被酶标板，每个浓度 1 行，12 孔，100μL/孔，4℃冰箱过夜；

(2) 加抗血清(一抗)：用 PBST 溶液系列稀释抗体储液(1﹕100~1﹕500)，按稀释顺序加入到酶标板中，每个浓度加 2 列，共 16 个孔，室温温育 30min。

(3) 其它步骤均如前述。

选择 A 值为 1.0 左右时的包被抗原和一抗的稀释度作为工作浓度。

4.3.1.4 操作步骤

（1）将抗原用包被液稀释成适当浓度，以每孔100μL的量加入酶联反应板中；

（2）放入37℃温箱中2h或4℃冰箱中过夜，取出后倒掉余液并用200μL/孔的洗液洗板三次，间隔每次3min，之后拍干；

（3）每孔加入200μL的封闭液放入37℃温箱2h，取出后直接拍干；

（4）每孔加入100μL稀释血清，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，拍干；

（5）每孔加入100μL的一定浓度的酶标二抗，放入37℃温箱30min，取出后洗涤同上，之后拍干；

（6）每孔加入TMB溶液100μL，之后放入37℃温箱15min，取出后每孔加入100μL终止液，并用酶标仪中测定光密度(optical density, OD)值。

（7）测定OD值。4.3.2 ELISA 方法的优化[1-3]

4.3.2.1 包被时间的选择

用选定的包被溶液将包被抗原稀释至最适浓度，同时包被数块酶标板，每孔100μL分别置于37℃1h、37℃1.5h和37℃2h，评价不同包被时间对IC50影响，考察其对IC50的影响,确定最佳包被、封闭时间。

4.3.2.2 封闭液的选择

分别采用1%明胶以及2%的OVA作为封闭液。并进行比较，进一步确定明胶的浓度以及稀释液的PH。

4.3.2.3 封闭时间的选择

37℃下将封闭时间分别设为1h，2h和2.5h，考察其对IC50的影响。

4.3.2.4 最优温育时间和温度的确定

工作浓度稀释的一抗和 TAP 标准液在竞争步骤之前混合在一起，然后在不同温度

下预温不同时间：4℃冰箱中过夜、室温下 1h 和 0h，然后分别添加到板中，在室温下，分别温育 5、15、30、60 和 120min。最后按前面介绍的步骤洗涤，测定。

4.3.2.5 PBS浓度的选择

改变PBS缓冲液的浓度分别为0.05、0.02、0.01、0.005mol/L，考察盐浓度对IC50的影响。

4.3.2.6 Tween-20最优浓度的确定

用含不同浓度Tween-20(1，0.5，0.1，0.05，0.01，0.005，0.001%)的PBS溶液稀释抗体(一抗和二抗)，配制TAP标准溶液，同时在一块酶标板上测定。

4.3.2.7 抗体工作液pH值的选择

按上述已选定的ELISA反应条件，将抗体工作液的pH值调为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5和10.5，考察pH值对IC50的影响。

4.3.2.8 二抗反应时间的选择

将二抗反应时间分别设为15min、20min和25min，考察其对IC50的影响，确定最佳酶标二抗的反应时间。

4.3.2.9 显色时间的选择

将显色时间分别设为10min、15min和30min,考察其对IC50的影响，确定最佳显色时间。

4.3.2.10 TMB储存液与底物缓冲液比例的确定

将TMB储存液与底物缓冲液按1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8的比例混和，考察其对IC50的影响，以选择最佳的比例。

4.3.2.11 TAP 与抗体体积比的选择

将TAP标准溶液与抗体体积比分别选择为20﹕80、30﹕70、40v60、50﹕50、60﹕40、70﹕30和80﹕20，考察其对IC50的影响，确定最佳NT标液与抗体的体积比。

4.3.2.12 标注曲线的建立

建立竞争ELISA方法以检测药品对抗体的抑制反应。具体操作步骤同4.3.1.4，但是包被抗原和抗体为工作浓度，并且在加入抗体的同时，加入标准品稀释液，其浓度分别为0ng/mL、0.35ng/mL、0.7ng/mL、1.05ng/mL、2.1ng/mL、4.2ng/mL、8.4ng/mL、16.8ng/mL、

33.16ng/mL，做标准曲线。

4.3.2.13 ELISA灵敏度实验

以OD-2SD公式法计算灵敏度。零空白同时做10个，利用统计学原理对结果进行处

理，得出灵敏度。4.3.3 ic-ELISA 方法评估[57-61]

1 板间、批间和批内误差

(1)板内误差：将一块酶标板分成 3×8 四个部分，按 ic-ELISA 方法同时测定。每

个浓度 3 个平行孔。

(2)批内误差：从同一批包被、封闭的酶标板中的相同位置，每板抽取 3 条酶标板

条，用同一批配制的溶液测定。

批间误差：从不同批包被、封闭的酶标板中随机抽取 4 块板，再从这 4 块板中的

相同位置，每板抽取 3 条酶标板条，用各自批次的溶液测定。

2 添加回收率的测定

(1) 样品中甲砜霉素的提取

称取10.0 g左右经过匀浆的组织样品于50 mL 聚四氟乙烯塑料离心管中加入3g 无水硫酸钠 , 混合均匀，再加入20 mL碱化乙酸乙酯（乙酸乙酯/25%氨水，97+3 V/V）,振荡提取10min，5500r/min 离心10 min，分出上清液。连续提取三次，合并提取液,在45-50℃水浴旋转蒸发掉大部分溶剂，剩余溶剂用氮气吹至近干, 用4 mL 乙酸乙酯分两次将提取物转移至另一支试管中，同时弃去不溶物。再次将乙酸乙酯溶液蒸发至近干后，加入4 mL 甲醇溶解提取物，加入4% 的NaCl 溶液，摇匀；再加入正己烷，萃取，弃去正己烷层；向水层中加入乙酸乙酯，振荡，静置分层后，弃去水层；有机相氮气吹至近干待固相萃取柱进一步净化。

(2) 固相萃取净化样品

6 mL 硅胶小柱依次用 5 mL 乙腈、5 mL 体积比为 50﹕50 的二氯甲烷和正己烷的混合液活化；500μL 二氯甲烷溶解上步中提取液残留物后上样；5 mL 体积比为 50﹕50的二氯甲烷和正己烷的混合液淋洗，弃去淋洗液；用 5 mL 的乙腈水溶液洗脱，洗脱液用 3 mL 乙酸乙酯分 3 次提取，合并提取液并吹干，用 5 mL 的乙腈水溶液溶解残留物，待 C18柱进一步净化。6 mL C18小柱依次用 5 mL 甲醇、5 mL 水活化，上样，5 mL 水淋洗，弃去淋洗液，5 mL 甲醇洗脱，吹干洗脱液。

(3) 按照优化的 ic-ELISA 步骤进行测定。分别用 PBST 和血液上清液作空白对照，TAP标准液和上面处理好的各种样品液与抗体按 30﹕70 的比例添加。每个浓度 3 个平行孔。(4) 回收率的计算：根据不同样品浓度的吸光度值计算相应的抑制率，再根据相应的抑制率从标准曲线上查到各自的浓度。检测浓度与真实浓度之比即为对应浓度的回收率。

3 交叉反应率(Cross-reactivity CR)的测定

(1)TAP 的几种结构类似物甲砜霉素（TAP）、土霉素、氯霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、红霉素、青霉素作为与抗体的竞争物，按照优化的 ic-ELISA 操作步骤进行测定，求出各自的 IC50%值。

(2) CR(%)＝TAP 标准曲线的 IC50%／结构类似物的 IC50%×100%。

4 与 gc 方法的比较

检测的两个样品为中国进出口商品检验局已经用 gc 方法确证的肌肉和肝脏样品，TAP 含量分别为 2.8 和 3.4ng/mL。用自己的 ic-ELISA 同时检测这两个样品，与 gc 比较检测效果。每个浓度均为 4 个平行孔。

5 试剂盒的低温保存实验

通过绘制标准曲线的方法，来检验整体试剂盒的活性变化。试剂盒一次性生产 4 个，先用其中的一个测定一下原始活性，以后每一个月测定一次。

4.4 结果与讨论

4.4.1 酶标板的选择

每种板随即取两块，做同一浓度标准品 8 个孔，结果如下表 4-1。

表 4-1 不同板性能之间的比较

Fig.4-1 Characteristic Comparision Of diffrend microplates

浓度

(ng/mL)

酶标板 OD450值 变异

系数

CV %

0.5 国产1.02 1.22 1.25 1.31 1.42 1.23 1.32 1.15 23.18

1.05 1.26 1.24 1.35 1.30 1.26 1.28 1.19 17.68

0.5 Fa$$lcon 公司1.51 1.56 1.54 1.59 1.56 1.53 1.55 1.52 3.60

1.48 1.52 1.56 1.57 1.53 1.56 1.52 1.51 4.19

0.5 Costar 公司1.68 1.73 1.73 1.75 1.76 1.74 1.73 1.71 3.29

1.69 1.72 1.74 1.78 1.77 1.75 1.72 1.71 3.27

0.5 Nunc 公司1.82 1.83 1.85 1.88 1.86 1.85 1.83 1.82 2.29

1.81 1.83 1.85 1.89 1.86 1.84 1.83 1.81 3.06

从表中可以看出，国产酶标板的孔间变异系数很大，其结果是假阳性或假阴性的比例非常高。一般国外酶标板的孔间板间变异系数都在 10%以下，可靠性比较高。相对来说，进口酶标板的效果要比国产的的要好一些。国产酶标板的缺陷比较突出，重点是在均一性较差，但是在前期的基础实验，比如方阵实验、抑制实验可以用。进口酶标板的最突出的两个特点一是均一性好，孔与孔之间的变异系数非常小；二是吸附能力强，

“NUNC”为例，它的每孔(0.32m2)吸附量为 159 ng,几乎是国产的两倍到三倍，同国产板相比，可以将检测限降低一倍。进口板板间 CV%<10%，无明显差异(p<0.05)。国产板孔间异太大没有进行板间差异的计算。但 Nunc 公司的酶标板价格差不多为其它三种进口板的 2 倍，因此选择 Costar 公司的板进行下步实验。

4.4.2 HRP-IgG 和显色液中 H2O2 的工作浓度的确定

图 4-1 表示在不同的 H2O2浓度下，HRP-IgG 稀释倍数和平均吸光度的图。从图可以看到，其他条件均相同的情况下，H2O2浓度越大，OD 值越大。但是 H2O2浓度为 0.1%和 0.05%时，吸光度差异不显著。说明显色时间 20min，H2O2超过一定浓度，对 OD 值的影响不是主要因素。HRP-IgG 以 1﹕1000 和 1﹕2000 的比例稀释， H2O2浓度分别为0.005%和 0.01%时的平均 OD 值均较接近 1.0，所以选择 1:2000 作为 HRP-IgG 的工作浓度，0.01%作为显色液中 H2O2的工作浓度更好一点。

二抗稀释倍数

图 4-1 HRP-IgG 和 H2O2的工作浓度的确定

Fig.4-1 Determination the working concentration of HRP-IgG and H2O2

4.4.3 包被抗原和一抗工作浓度的确定

从图 4-2 可以看到，抗体浓度和包被浓度均比较大或均比较小的时候，OD 值相差

不是很大。原因可能是，浓度太高时，空间因素影响了抗原抗体的结合；而包被浓度太

低时，各抗体浓度均已达到饱和所致。包被抗原 1:4000 和 1:5000 稀释时，各稀释度的

抗体的 OD 值线性最好。只有抗体 1﹕100 和 1﹕200 稀释，相应抗原以 1﹕5000 和 1﹕

4000 稀释时，OD 值分别为 0.96 和 0.98，最接近 1.0。因此，选择抗原 1﹕4000 稀释，

抗体 1﹕200 稀释作为两者的工作浓度。因为此时线性最好，抗体稀释度也比前者低。

图 4-2 包被抗原和一抗工作浓度的确定

Fig. 4-2 Determination the working concentration of coating antigen and primary antibody.
4.4.4 ELISA 参数的优化

(1) 包被时间的确定

包被液中的蛋白质浓度在0.1～2.0×103 μg/mL的范围时，聚苯乙烯塑料表面均能吸

附较多的蛋白质，常用浓度为1～10μg/mL。浓度过高时，蛋白质分子间的相互作用力妨

碍了聚苯乙烯载体表面与蛋白质的吸附。实验证明，两种不同浓度的蛋白质包被液包被

固相并经过足够的洗涤后，固相表面的最后浓度几乎相等，一次蛋白质浓度过高的包被

液不仅浪费试剂，在测定中不仅可能会产生前带现象，还会降低检测敏感性。聚苯乙烯

载体中加入定量的蛋白质包被液后，多数在4 ℃冰箱过夜，让固相表面充分吸附，或用

37℃2h也可以达到同样的效果。蛋白质吸附于聚苯乙烯酶标板的动力学研究表明：加入

包被液后1分钟，固相上便发生吸附作用，吸附量与蛋白质浓度、包被时间有关。当蛋

白质浓度为5μg/mL时，包被60分钟出现明显吸附，12小时后吸附量不再随时间的延长而

增加；蛋白质浓度为10μg/mL和20μg/mL时，两者的吸附作用类似，包被3分钟便出现明

显吸附，6小时后吸附完全。用抗原包被后，固相在固体表面往往尚残留少量的未饱和

的吸附位点，其后加入的蛋白质也会部分的被非特异性的吸附，导致本底偏高。为此，

常在包被后用封闭液封闭，消除此干扰。

取数块包被酶标板，用选定的包被溶液将包被抗原稀释至最适浓度，同时包被数

条酶标板，每孔100μL分别置于37 ℃1 h、37 ℃1.5 h和37 ℃2 h，评价不同包被时间对

IC50影响。由下表可知，抑制率和Amax/ IC50都随着时间的增加而减小，因而可以选择

较短的时间1小时。

表4-2 包被时间的影响

Tab. 4-2 The effection of coating time

37℃ 1 h 37℃ 1.5 h 37℃ 2 h

IC50 (ng/mL) 0.398 0.406 0.507

Amax/ IC50 1.566 1.479 1.339

(2) 封闭液的选择

用抗原包被酶标板后，固相载体表面往往尚残留未饱和的吸附位点，其后加入的 标

本和酶结合物中的蛋白也会部分的被非特异性吸附，导致本底偏高。为此常在包被后用

BSA，小牛血清，OVA， 明胶等封闭未饱和的吸附位点。在本实验中，发现明胶有良

好的封闭效果，所以选择了明胶作为封闭液。

分别采用1%明胶以及2%的OVA作为封闭液。并进行比较，进一步确定明胶的浓度

以及稀释液的PH。

表 4-3 封闭液的影响

Tab. 4-3 The effection of blocking solution

1%明胶 2%的 OVA

IC50 (ng/mL) 0.699 0.739

Amax/ IC50 1.034 0.609

表 4-4不同PH的明胶稀释溶液的影响

Tab. 4-4 Effect of the pH of blocking solution

pH 6 7 8 9 10

IC50 (ng/mL) 0.61 0.599 0.524 0.587 0.658

Amax/ IC50 1.285 1.198 1.408 1.211 1.201

表 4-5 不同稀释度的明胶稀释溶液的影响

Tab.4-5 Effect of the different concentration of blocking solution

稀释度 0.10% 0.20% 0.30% 0.40% 0.50% 1.00%

IC50 (ng/mL) 0.674 0.646 0.708 0.701 0.655 0.725

Amax/ IC50 1.8 1.822 1.64 1.676 1.87 1.617

从以上结果中可以看出，明胶的封闭效果良好，用pH8的稀释液以及0.2%的稀释度为好。

(3) 37℃下将封闭时间分别设为1h，2h和2.5h，考察其对IC50的影响。见表8可知，封闭时间为1小时的IC50比2.5小时的要稍大，但是考虑到同等条件下1小时时候的吸光值比2.5小时的大，且省时，实验选择在37℃下培育1小时。

表4-6 封闭时间的影响

Tab. 4-6 The effection of blocking time

1h 2h 2.5h

IC50（ng/mL） 0.23 0.299 0.142

Amax/ IC50 3.855 2.401 3.926

Amax（同等条件下） 0.886 0.719 0.607
(4) 最优温育时间和温度的确定

图4-3、4-4和4-5分别为TAP标准溶液和抗体溶液在竞争步骤前混合，在不同温度下

预温不同时间，各参数随竞争时间变化的曲线。有许多文献报道，ic-ELISA实验中，标

准溶液与抗体在不同温度下预温不同时间对测定灵敏度有很大的影响。为此，在添加到

酶标板竞争之前，使TAP标准溶液与抗体溶液混合，分别在4℃冰箱中过夜、室温预温

1h和0h。从这三个图可以看到，TAP标准溶液与抗体溶液预温对IC50虽有影响，但并没

有如文献中报道的那样影响大，特别是预温1h和没有预温，基本上没有什么区别。而在

板中的竞争时间对测定灵敏度却有较大的影响。IC50和Amax竞争时间(5～30min)增加而

增大，而后基本上趋于稳定，并不随时间延长而有太大的变化；而Amax/IC50在30min时

最大。为此选择30min为竞争时间。

图 4-3 温育时间对免疫反应的影响-(4℃过夜)

Fig .4-3 Effect of the incubation time on the TAP immunoassay-overnight at 4℃第四章 ELISA 方法的建立与优化

图 4-4 温育时间对免疫反应的影响-(室温)

图 4-5 温育时间对免疫反应的影响-(不温育)

图 4-6 PBS 离子强度对免疫反应的影响

PBS 的离子强度对 ic-ELISA 的影响，不同的文献，报道的结果也都不相同。因此

有必要研究 PBS 离子强度对本实验的影响。如图 4-6 所示，PBS 浓度对 TAP 的 ic-ELISA

有很明显的影响。最大吸光度 Amax 和 IC50均随着 PBS 溶液的离子强度增加而减小。

PBS 浓度为 0.2mol/L 时，Amax/ IC50 最大，所以选择 0.2mol/L 为 PBS 的最佳浓度。

(6) Tween-20 最优浓度的确定

Tween-20 为非离子型表面活性剂，广泛应用于 ELISA 实验中，减少非特异性吸附。

图 4-7 为 PBS 溶液中 Tween-20 对本实验的影响图。从图 4-7 可以看到，Tween-20 浓度

小于 0.05%时，Amax 和 IC50均减小；大于 0.05%时，IC50增大，而 Amax 表现为无规

律；等于 0.05%时，IC50最小，Amax/IC50最大，因此选择 0.05%为 Tween-20 的最优浓

度。

0

图 4-7 Tween 20 对免疫反应的影响

Fig. 4-7 Effect of the detergent Tween 20 on the TAP immunoassay

(7) PBS溶液的最优pH的确定

由于 pH 可以影响 TAP 标准溶液和其它试剂的离子化，因此 pH 对非共价结合的抗

原抗体反应和 ELISA 测定灵敏度有影响。为研究 pH 对本实验的影响，PBS 溶液和 TAP

标准溶液 pH 调整为 0.25~10.5。图 4-8 即为不同 pH 对 ic-ELISA 实验影响的图。从图中

可以看到，pH 小于 8.5 时，随 pH 增大，IC50急剧减小，Amax 有下降趋势，但下减幅

度不是很大。PH 小于 5.5 时，反应被完全抑制。PH 等于 8.5 时，Amax 为 0.88，IC50

比较小，同时 Amax/IC50最大，综合考虑起来，8.5 为 PBS 和 TAP 标准溶液的最佳 pH。

图 4-8 PBS pH 值对免疫反应的影响

Fig.4-8 Effect of the pH on the TAP immunoassay

(8) 二抗反应时间的选择

将二抗反应时间分别设为15 min、20 min和25 min，考察其对IC50的影响。下表中，

三个条件下的Amax/IC50差不多，但是20min的IC50明显较另外两个小，所以选择20 min

为二抗反应时间。

表4-7 二抗反应时间的影响

Tab. 4-7 The effection of reaction time of HRP-IgG

15min 20min 25min

IC50 (ng/mL) 8.8 7.3 8

Amax/ IC50 0.125 0.149 0.145
(9) 显色时间的确定

将显色时间分别设为5min、10min和15min,考察其对IC50的影响。随着时间的增加，IC50先增加后减小，颜色也逐渐变深，因此选择时间较小的为好，但是时间太长会导致底色增加，所以实验室选择15min为显色时间。

表4-8 显色时间的影响

Tab. 4-8 The effection of obvious time

显色时间 5min 10min 15min

IC50 (ng/mL) 0.586 0.623 0.574

Amax/ IC50 1.022 1.374 2.076

空白值 0.076 0.083 0.096

(10) TMB储存液与底物缓冲液比例的确定

将TMB储存液与底物缓冲液按1﹕2、1﹕4、1﹕6、1﹕8的比例混和，考察其对IC50的影响，结果见表3-7。从表3-7可见，TMB储存液与底物缓冲液比例对竞争反应有较大影响，其体积比为1﹕4时，Amax/ IC50的值最大，因此本研究选择体积比为1﹕4。

表4-9 TMB储存液与底物缓冲液比例对反应的影响

Tab. 4-9 Effect of proportion TMB and substrate solution on the TAP immunoassay

体积比 1﹕ 2 1﹕ 4 1﹕6 1﹕ 8

IC50 (ng/mL) 7.23 6.35 7.9 11.72

Amax/ IC50 0.083 0.114 0.089 0.059

(11) TAP标液与抗体体积比的确定

将TAP标准溶液与抗体体积比分别选择为20﹕80、30﹕70、40﹕60、50﹕50、60

﹕40、70﹕30和80﹕20，考察其对IC50的影响。见表9。综合两项指标，选择70:30的体

积比。

表4-10 TAP标准溶液与抗体体积比对反应的影响

Tab.4-10 Effect of proportion TAP standard solution and antigen solution on the TAP immunoassay

20﹕80 30﹕70 40﹕60 50﹕50 60﹕40 70﹕30 80﹕20

IC50 (ng/mL) 3.206 1.984 1.447 0.982 0.62 0.363 0.285

Amax/ IC50 0.317 0.482 0.632 0.885 1.479 2.748 2.324

4.4.5 标准曲线初步确立

y = -0.5184x + 0.6531

R2 = 0.9963

-0.5

0

0.5

1

-1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2

log C

ogitl系线列性1 (系列1)

图4-9 TAP检测ELISA方法的标准曲线图Fig.4-9 The calibration curve of ELISA

以上面确立的间接竞争性ELISA模式做用PBST配置的0ng/mL、0.35ng/mL、0.7ng/mL、1.05ng/mL、2.1ng/mL、4.2ng/mL、8.4ng/mL、16.8ng/mL、33.16ng/mL做ELISA实验，结果表明，平行空的变异系数平均为3.4%。根据平均值绘制用㏒it-㏒C甲砜霉素的工作曲线。结果见图4-9，在0.1～34.7 ng/mL其线性良好。
4.4.6 ELISA 灵敏度实验

以OD-2SD公式法计算灵敏度。零空白同时做10个，利用统计学原理对结果进行处理，得出灵敏度。

4.4.7 添加回收率的测定

已知浓度的TAP溶液添加到各样品中，采用ic-ELISA方法检测，各个浓度的检测结果见表4-12。从表中可以看到，添加浓度比较低的时候，平行孔间的变异系数相对较大，但都在允许范围内(<15%)，回收率也比较低。鱼血清的回收率在测定浓度范围内，不管高低，都在90%以上。而组织样品的回收率都比较低，特别是1ng/g时，更低。这可能是样品处理过程中损失造成的。除了个别样品，大部分也还在可接受范围内(<20%)。

表 4-12 添加回收率测定结果

Tab.4-12 The average recoveries of different samples were analyzed by ic-ELISA

样品 编号 添加 TAP 的浓度(ng/g) 平均值 变异系数(CV%.) 回收率(%)

0.2 0.14 14.4 70

1

0.5 0.40 12.5 80

1.0 1.02 8.5 102

2

2.0 1.94 8.9 97

5.0 5.04 6.4 101

鱼血清

3

10.0 9.81 7.8 98.1

1 0.82 11.4 82

1

5 4.95 7.8 99

1 0.88 10.8 88

2

5 4.85 8.2 97

1 0.86 11.4 86

鱼肾

3

5 4.81 8.9 96.2

1 0.79 12.4 79

1

5 4.15 10.3 83

1 0.74 12.4 74

2

5 4.55 8.4 91

1 0.82 9.6 82

鱼背肌

3

5 4.35 7.9 87

4.4.8 试剂盒特异性的确定

采用 11 种 TAP 的结构类似物来检测其特异性。分别针对砜霉素（TAP）、土霉素、

氯霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素、四环素、泰乐菌素、卡那霉素、红霉素、青霉素

进行交叉反应实验，根据下列公式计算交叉反应率：

交叉反应率（%）= 引起 50%抑制的 TAP 的浓度/引起 50%抑制的类似物的浓度 ×

100

结果见表 4-13。从表可见，试剂盒所采用抗体针对 TAP 有交叉反应（TAP100％），

抗体对其他抗生素类药物没有交叉反应。

表4-13 抗体与其它抗生素的交叉反应率

Tab. 4-13 Cross-reactivity of TAP antiserum with other antibiotics

抗生素 交叉反应率%

氯霉素 0.4

泰乐菌素 <0.01

链霉素 <0.01

四环素 <0.01

土霉素 <0.01

青霉素 <0.01

红霉素 <0.01

庆大霉素 <0.01

新霉素 <0.01

卡那霉素 <0.01

甲砜霉素 100
4.4.9 板间、批间 和批内误差检测结果分析

同一块板分成 3×8 四个部分，每个浓度 3 个对照，同时测定，比较孔间差异；随机从同一批包被、封闭的板中抽取 4 块，再从这 4 块板中，每块板随机抽取 3 条板条，比较批内 CV；批间 CV。从不同批次包被、封闭的板中随机抽取 4 块，每块板再随机抽取 3 条。测定结果如表 4-14 所示。板内 CV 要小于批内和批间 CV，所有 CV%都小于 15%。

表 4-14 板间、批间和批内差异的测定结果

Tab. 4-14 Coefficient of variation between microplates、batches and in batches

TAP 标准溶液浓度(ng/mL)

空白 0.0 0.1 0.3 0.9 2.7 8.1

%CV(板内) 7.4 4.7 5.6 5.8 2.6 3.8 2.9

%CV(批内) 9.5 6.9 8.2 7.9 6.5 5.7 6.1

%CV(批间) 13.2 13.7 11.5 12.1 7.8 8.5 10.3

4.4.10 与 gc 方法的比较

已由 gc 确证浓度的两个样品，用自己的 ic-ELISA 同时检测这两个样品，与 gc 比较检测效果，每个浓度均为 4 个平行孔。

表 4-15 试剂盒与 gc 的比较结果

Tab.4-15 Comparative results between ELISA kit and gc

检测方法 检测样品(ng/mL) 检测时间 回收率

1 2 样品 1 样品 2

自己的 2.5 3.1 <2h 89.4 92.2

gc 2.8 3.4

从上面分析结果可以推知，该 ic-ELISA 检测与 gc 比较，检测结果重现性好。

4.4.11 试剂盒的低温（2-8℃）保存实验

通过反复试验，可以确定试剂盒放置在2-8℃的环境中，至少可保存3个月以上。通过绘制标准曲线的方法，来检验整体试剂盒的活性变化。试剂盒一次性生产4个，先用其中的一个测定一下原始活性，以后每一个月测定一次。结果见图 4-10 ，从图中可以看出，在低温条件下，试剂合保存了了三个月，结果重现性很好。

图4-10 试剂盒低温（2-8℃）保存实验

Fig.4-10 The experiment of kit in low temperature

4.4.12 ic-ELISA 的影响因素

ELISA 方法检测步骤和使用试剂多，影响因素也就多。

1. 酶标板的影响

良好的 ELISA 板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。由于所用材料、配料和制作工艺等的不同，不同厂家的产品，甚至同一家厂家不同批次的产品，质量差异很大。在实验中，选择了几种目前有代表性的厂家的板，经过检测，国产板性能还不能满足定量 ELISA 的需要。NUNC 公司的板性能最佳，但是价格太高，后选择了美国 Costar 公司的板。

2. 包被、封闭、洗涤、加样、保温的影响

蛋白质交联到酶标板上，蛋白质空间构象有可能发生改变，从而造成抗原决定簇的丢失，浓度越低越容易改变。包被浓度过高，蛋白质则有可能发生聚集，则结合在板上的蛋白质上面可能在结合一层蛋白质，从而掩盖了抗原决定簇。因此，包被浓度和封闭蛋白的浓度均需要经过多次反复的实验才能确定。

洗涤在 ELISA 过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。洗涤如不彻底，特别在最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，一抗内的非特异性 IgG 吸附在固相上而未被洗净，也将与酶标二抗作用而产生干扰。聚苯乙烯塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此，ELISA 测定的反应过程中，非特异性吸附难以避免，洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。一般常在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯(吐温，Tween)一类物质，ELISA 实验中，Tween-20 比较常用，它的洗涤效果好，并具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。

抗原抗体反应在一定温度和时间内完成。考虑到实际运用中，各实验室的条件不一，因此各测定步骤均在室温下温育，尽管室温并不是抗原抗体的最佳反应温度。但是温育时间必须用定时钟严格控制，过长或过短都会影响测定结果。各 ELISA 板也不能叠在一起温育，为避免蒸发，温育时应该加盖密封。

为了减少人为误差，现在已经有了配套的、自动化的包扳机、洗板机、加样设备。更高级的检测设备所有步骤均可自动完成，这就极大地提高了检测重复性和稳定性。

3. 显色系统的选择

HRP 常见的显色底物有邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺(TMB)和 ABTS 3 种，以OPD 和 TMB 二种最为常见。

OPD 为在 ELISA 中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。在实验初期，抗体效价测定和亲和常数测定中即是采用 OPD 显色。但是 OPD 见光易分解，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配现用，而且具有致异变性的缺点，因此在试剂盒中很少使用 OPD 作为 HRP 的底物。OPD 终止后显棕色，测定波长为 492nm。

TMB 经 HRP 作用后，产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与 H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB 没有致癌性等优点，因此在 ELISA 中应用日趋广泛，尤其是在试剂盒中基本上都是采用 TMB 作为 HRP 的底物。酶反应用 HCl 或 H2SO4终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为 450nm。ABTS 虽不如 OPD 和 TMB 敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。

HRP 对氢受体的专一性很高，仅作用于 H2O2、小分子的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。尿素过氧化物为固体，作为试剂较方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定 1 年。但H2O2 应用最多。
4. ic-ELISA 检测条件的优化

ic-ELISA 受实验条件的影响很大，查阅大量的文献，以及根据以往的实验经验，Tween-20 的浓度、PBS 溶液的浓度及其 pH、竞争温育时间，底物温育时间等几个参数对实验的影响最大。根据四参数方程中各参数的变化情况，分别对这几个参数分别进行了反复的实验比较，最后确定了较佳的实验条件。需要说明的是实验参数的确定需要多次、反复，不断的调整比较，特别要严格控制好溶液的 pH。ELISA 试剂的选择也很重要，如酶标二抗，各个厂家的产品质量也是相差很大，可以多购进几家公司的常品来比较，确定下来后还要比较此公司不同批号的质量，最后确定下来厂家和批号后，就一次性购足同一批号的二抗，自己保存。

4.5 本章小结

1. 根据ELISA原理，通过实验，对实验条件行了摸索，选择了适合本研究的酶标板，通过方阵法，测定了酶标二抗和包被抗原以及一抗的工作浓度分别为1﹕2000，1﹕4000和1﹕200，建立了TAP在鱼体内残留的免疫检测方法；

2. ELISA 方法检测步骤和使用试剂多，影响因素也就多。根据不同的影响因素对ELISA 方法的影响，对这些参数作了最优化处理，优化后的参数为：包被时间为 37℃1h；封闭液选择了 pH8 稀释 0.2% 的明胶，封闭时间为 37℃1h；温育时间为 37℃2h；抗体工作液的浓度为 0.2mol/L, pH8.5;Tween-20 的浓度为 0.05%；二抗的反应时间为 20 分钟，显色时间为 15 分钟；TMB 储存液与底物缓冲液比例为 1﹕4（V/V），TAP 标液与抗体体积比为 70﹕30（V/V），建立了优化的 ELISA 检测方法；

3. 经过优化后，用实际样品进行检验，并对本方法进行了评估：灵敏度为 0.06ng/mL;添加浓度比较低的时候，平行孔间的变异系数相对较大，但都在允许范围内(<15%)，回收率也比较低。鱼血清的回收率在测定浓度范围内，不管高低，都在 90%以上。而组织样品的回收率都比较低，特别是 1ng/g 时，更低。这可能是样品处理过程中损失造成的。除了个别样品，大部分也还在可接受范围内(<20%); 试剂盒所采用抗体针对 TAP 有交叉反应（TAP100%），抗体对其他抗生素类药物没有交叉反应；板内 CV 要小于批内和批间 CV，所有 CV%都小于 15%；ic-ELISA 检测与 gc 比较，检测结果重现性好，各个指标都达到了要求；

4. 经过保存实验，经过三个月后，试验的重复性很好，标准曲线重现性好。



第五章甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化

5.1 引言

5.1.1 药物残留分析简介

残留分析属于一种多学科交叉的方法学领域，分析对象和样品基质复杂，几乎所有

的分析理论和技术在残留分析中都得到了研究与应用，但色谱分析法一直占据主导地

位。纵观 20 多年来残留分析乃至整个分析化学领域的发展过程，检测限是残留分析方

法使用中最主要的限制因素，追求高灵敏和高分辨(分离)是分析方法发展的两个基本主

题。随着药物结构的日益复杂化、低剂量化和样品数量的增多，提高对这些物质的分析

能力和分析效率是残留分析的重要发展方向。各种现代色谱分析技术，如 HP$$lc、gc、

HPT$$lc 和 CE 都是典型色谱-波谱的联用技术，是残留分析中最重要和最基本的测定手

段。20 世纪 80 年代以来 HP$$lc 一直是残留分析的基本方法。gc/MS 是目前应用最活

跃的联用技术和成熟的残留确证分析技术，有种类齐全的标准 EI 谱库供计算机自动检

索。除去价格因素之外，理论上$$lc/MS是相当完善的联用技术。HP$$lc作为MS或MS/MS

的进样系统，MS 也可被看作 HP$$lc 通用和高灵敏的检测器，是分离、结构鉴定和定量

一次完成，从而实现对形形色色物质的确证分析。现在对研究甲砜霉素残留的检测研究

论文很少，国内的更少，检测方法主要有 HP$$lc[1-4]， HP$$lc/MS/MS[5-6]，gc[7-10]，

gc/MS[11-12 ] 。

5.1.2 本章研究的目的和主要内容

ELISA 方法只能做为筛选的方法，检出的阳性结果还必须用仪器分析的方法来最后

鉴定。本章主要研究甲砜霉素残留的高效液相色谱，高效液相色谱质谱联用，气相色谱

质谱联用三种仪器检测方法。本章的主要研究内容：

1）甲砜霉素残留的提取净化方法研究；

2）甲砜霉素残留的高效液相色谱，高效液相色谱质谱联用，气相色谱质谱联用方法的

建立；

3）气相色谱质谱联用方法的优化。

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料江南大学博士学位论文

72

甲砜霉素标准品(美国 sigma 公司)；双三甲基硅基三氟乙酰氨(BSTFA) ；三甲基氯

硅烷(TMCS)；SylonHTP(六甲基二硅胺-三甲基氯硅烷-吡啶，体积比 3﹕9﹕1) ；

SylonBFT(N,O-双三甲基硅烷基三氟乙酰氨-三甲基氯硅烷，体积比99:1)均为美国

Supe$$lco 公司产品，购自于上海医药集团；甲醇、乙酸乙酯、正己烷为色谱纯，已腈、

二氯甲烷、25%氨水、冰醋酸、氯化钠、醋酸銨、无水硫酸钠为分析纯。固相萃取柱：

C18 小柱，容积 6 mL (美国 Supe$$lcoPark 公司) , 硅胶小柱,容积 6 mL (美国 Phenomenex

公司) 。自己配水为去离子水，氮气、氩气(＞99.999%)。

新鲜活鱼购于北京。

5.2.2 实验仪器

1）高效液相色谱仪 Waters2695 美国 Waters 公司

2）气质联用仪 6890/5972 美国 Agilent 公司

3）质谱检测器 ZQ4000 质谱 美国 Waters 公司

4）旋转蒸发仪 RE-52-2 上海亚荣生化仪器厂

5）烘箱 DHG9053 上海基伟实验仪器设备有限公司

6）酸度计 DELTA320-S 梅特勒-托利多（上海）

7）分析天平 AB104-N 梅特勒-托利多（上海）

5.2.3 实验方法

5.2.3.1 标准溶液的配置

甲砜霉素标准溶液的配制：准确称取 100mg 左右甲砜霉素，用甲醇定容至 100 mL，

取该溶液100μL稀释至10mL作为工作溶液，配置一系列不同质量浓度的标准溶液(0.45，

4.5，9.0，18.0，45.0，90.0，180.0μg/L)。

5.2.3.2 样品前处理

1） 样品中甲砜霉素的提取

称取10.0 g左右经过匀浆的组织样品于50 mL 聚四氟乙烯塑料离心管中加入3g无水

硫酸钠, 混合均匀，再加入20mL碱化乙酸乙酯（乙酸乙酯/25%氨水，97+3 V/V，振荡

提取10min，5500r/min 离心10 min，分出上清液。连续提取三次，合并提取液，在45-50

℃水浴旋转蒸发掉大部分溶剂，剩余溶剂用氮气吹至近干, 用4 mL 乙酸乙酯分两次将

提取物转移至另一支试管中，同时弃去不溶物。再次将乙酸乙酯溶液蒸发至近干后，加

入4 mL 甲醇溶解提取物，加入4% 的NaCl 溶液，摇匀；再加入正己烷，萃取，弃去正

己烷层；向水层中加入乙酸乙酯，振荡，静置分层后，弃去水层；有机相氮气吹至近

干待固相萃取柱进一步净化。

2） 固相萃取净化样品第五章甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化

73

6 mL硅胶小柱依次用5 mL乙腈、5mL 体积比为50﹕50的二氯甲烷和正己烷的混合

液活化；500μL二氯甲烷溶解上步中提取液残留物后上样；5mL体积比为50﹕50的二氯

甲烷和正己烷的混合液淋洗，弃去淋洗液；用5 mL的乙腈水溶液洗脱，洗脱液用3 mL

乙酸乙酯分3次提取，合并提取液并吹干，用5 mL的乙腈水溶液溶解残留物，待C18柱进

一步净化。6 mL C18小柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，上样，5 mL水淋洗，弃去淋洗

液，5 mL甲醇洗脱，吹干洗脱液。待衍生化。

3） 样品衍生化

用N2 吹干上述提取液,加入100 μL 衍生试剂,密封后70 ℃衍生1 h；衍生完毕，N2

吹干多余的衍生试剂,加正己烷定容至0.5mL，待gc-MS 分析。

样品 10 g

Na2SO4, 碱化乙酸乙酯，（均质/超声/振荡）提取，

离心，然后旋转蒸发

甲醇，4%氯化钠溶解，正

己烷除蛋白

水相

甲醇溶解

HP$$lc SPE

gc/MS, HP$$lc/MS

图 5-1 样品中 TAP 残留的提取程序和检测方法

Sche.5-1 Overview procedure for samplepreparation of TAP residue determination

乙酸乙酯提取，蒸干江南大学博士学位论文

74

5.2.3.3 实验条件

1）气质联用

色谱柱：HP-5MS，30 m × 0.25 mm id ×0.25μm。色谱条件：载气为高纯 He，

流量 1 mL/min；不分流进样，进样量 1.0 μL；进样口温度 250℃；温度梯度：1 00 ℃(1

min) 程序升温 30℃/min ，280℃(3 min)。质谱条件：质谱采用NCI 离子源，选择 m/z

409、411、499、501 进行选择离子检测（SIM）测定。在全扫描（SCAN）模式中，m/z

的扫描范围为 150～500。

2）液质联用

色谱柱：XTerra? MS C18 3.5μm，2.1×150mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L

醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 0.2 mL/min；柱温 30℃；进样

量 10μL。质谱条件：质谱采用 ESI 离子源，MRM 检测离子： 354/185(19eV),

354/290(12eV), 每个离子检测时间：0.2s，毛细管电压：3.00kV，锥孔电压： 80V，

去溶剂温度：350℃锥孔气流：100L/hr，去溶剂气流： 500L/hr，碰撞气体为氩气，碰

撞气压： 2.6×10-4 Pa。

4）高效液相色谱

色谱柱：XTerra? MS C18 5μm， 4.6,1×250mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L

醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 1 mL/min；柱温 30℃；进样量

20μL。检测器：二极管阵列检测器，检测波长为：224nm。

5.2.3.4 样品添加回收实验

取 10g 均质的样品于 50mL 聚四氟乙烯塑料离心管中，按 4.5，18.0，9.0，45.0，

90.0 浓度添加标准溶液，混匀，起去操作同5.2.3.2。

5.3 结果与讨论

5.3.1 提取与净化条件的选择

5.3.1.1 提取方法的选择与优化

生物样品十分复杂，含有成千上万种化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、核酸、氨基

酸、维生素、激素、无机盐、水分等。这些物质的分子结构、分子大小和理化性质各异，

其中许多化合物的性质目前尚不明确，其中任何一种物质的含量可能是兽药残留组分

(低于 1 mg/kg)的数百倍至数万倍以上。这些样品基质的存在不但干扰对待测物的检测，

而且污染仪器和降低设备使用寿命。与药品分析相比，残留分析的主要特点是样品基质

复杂、待测物含量低和需要繁琐的样品处理过程。

样品处理(sample treatment)的最终目的是将待测组分从样品基质中分离出来，并达

到分析仪器能够检测的状态。其主要作用包括将药物从样品中释放出来、除去样品中的

干扰杂质、将待测组分转换为可检测的形式、达到可检测的浓度范围和溶于可进行分析第五章甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化

75

的介质。样品处理过程通常包括以下四项基本内容：提取、净化、浓缩和衍生化。设计

样品处理方法必须考虑到待测组分的理化性质、存在状态、样品基质的化学组成、可能

的干扰物类型、处理方法对药物稳定性的影响和采用的测定方法。

血清、血浆中的甲砜霉素，经提取后可直接用 gc 或 HP$$lc 测定。组织样品需要用

液-液萃取或固相萃取柱作进一步净化，常用的固相萃取柱有 C18柱、硅藻土柱、氧化铝

和 Florsil。在 gc 和 $$lc 测定方法中，主要使用乙酸乙酯、甲醇或乙腈从试样中提取药

物。有人用饲养的黄鰤鱼研究了这些溶剂对这三种药物提取效率的影响[11]，取 10g 混匀

的样品，加入 5 μg 甲砜霉素和混匀，放置冰箱过夜。然后分别用 50 mL 甲醇、乙腈或

乙酸乙酷提取这三种药物，提取液浓缩后用 4％的氯化钠溶液溶解残留物，随后用正己

烷进行液一液萃取以除去脂类，再用乙酸乙酯把被测药物反萃回有机相，浓缩至近干，

残留物用甲醇一水(1+1)溶解，用 $$lc 测定。从表 5-1 看出，用甲醇和乙腈的提取效率没

有乙酸乙酯高，因此乙酸乙酯最适合作为这三种药物的提取溶剂。高浓度的样品经去蛋

白质处理后可直接测定，但对低浓度的样品则需适当的净化步骤。样品净化方法主要是

液一液分配法。

表 5-1 提取溶剂对黄鰤鱼中 TAP 回收率的影响[11]

Tab.5-1 The effect of extracted solvent forthe recovery of TAP in yellowtail

提取溶剂回收率（%）

氯霉素甲砜霉素

甲醇 75.5 89.8

已腈 81.1 97.4

乙酸乙酯 93.6 98.4

表 5-2 NaCl 浓度对 TAP 萃取效率的影响[11]

Tab.5-2 The effect of concentration of NaClfor the recovery of TAP

NaCl 浓度（%） 回收率（%）

氯霉素甲砜霉素

0 45.0 40.9

2 47.0 44.0

3 48.2 44.0

4 48.8 46.0

7 50.0 46.0

表 5-2 表明，在水溶液中加入 NaCl ，极性较强的甲砜霉素和也可用乙酸乙酯有效

地反萃取，但加入盐的浓度不宜太高，通常 NaCl 的浓度为 3％～4％。为了除去脂类，

常用正己烷、石油醚或异辛烷与含有这三种药物的水溶液进行液一液分配。

José E. Roybal 等[13]发现碱化乙酸乙酯对水产品具有更高的回收率，本实验采用碱化乙酸乙酯提取，浓缩后用 4%NaCl 和正己烷分配，再用乙酸乙酯反提，可以有效的去除

组织中的脂肪，进一步再用 SPE 柱净化。

为了保证甲砜霉素的回收率，在样品提取过程中，要至少重复三次溶剂提取。

样品提取条件的优化：溶剂为：乙酸乙酯；和碱化乙酸乙酯混合液(乙酸乙酯/25%氨

水，97+3 V/V)；碱化乙酸乙酯混合液(乙酸乙酯/25%氨水，97+3 V/V)加 3g 硫酸钠。

均质，超声和振荡作为第二个提取因素。结果如表 3 所示

表 5-3 用 gc-MS- CI-SIM 方法检测加标肌肉样品的提取效率

Tab.5-3 Optimization of extractionprocedures spiked muscle of TAP(1μg/kg)determined by gc-MS-

CI-SIM

序号分离 提取 回收率

1 均质 乙酸乙酯 0.85

2 碱化乙酸乙酯 0.89

3 碱化乙酸乙酯+硫酸钠 1.02

4 超声 乙酸乙酯 0.68

5 碱化乙酸乙酯 0.72

6 P BS和乙酸乙酯+硫酸钠 0.75

7 振荡 乙酸乙酯 1.02

8 碱化乙酸乙酯 0.97

9 碱化乙酸乙酯+硫酸钠 1.01

从表 5-3 中可以看出，在所选的溶剂中，碱化乙酸乙酯混合液(1﹕1，v/v)加 3g

硫酸钠的提取效率是最高的，这是因为在提取时向组织样品中加入硫酸钠，盐析作

用能够提高待测组分的回收率。在超声萃取过程中，可能是由于超声波部分破坏了

样品中的甲砜霉素的分子结构，所以回收率较。因此，选择了用碱化乙酸乙酯混合

液(1﹕1，v/v)加 3g 硫酸钠作为提取溶剂，振荡提取组分，取得了较好的效果。

5.3.1.2 净化方法的选择与优化[14]

为了消除样品基质对检测效果的影响，本实验使用了硅胶柱和 C18柱对样品进行

处理。采用不同的淋洗溶剂和洗脱溶剂来评价样品的进化效果。结果如表 5-4 所示。第五章甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化

77

表 5-4 用 gc-MS- CI-SIM 方法检测加标肌肉样品的硅胶柱的净化效果

Table5-4 Optimization of $$lc-Si SPEprocedure TAP(1μg/kg)determined by gc-MS- CI-SIM

配比淋洗液 洗脱液 平均回收率(%)(n=10)

从表5-4可以看出，对于硅胶柱，用20%的乙腈水溶液，50%的二氯甲烷和正己烷的

混合液活化硅胶柱，上样后，用50%的二氯甲烷和正己烷的混合液淋洗，然后用20%的

乙腈水溶液洗脱柱子，甲砜霉素的回收率最高。从表3中可以得到，对于C18柱，用甲醇，

水活化柱子，上样后，用水淋洗，然后甲醇洗脱柱子，甲砜霉素的回收率最高。

5.3.1.3 样品衍生化的优化[15]

为了选择一种有效的衍生化试剂，选择了SylonHTP，SylonBFT，BSTFA作为提取

样品的衍生化试剂。取1mg/L的甲砜霉素标准溶液，加入衍生化试剂，保持70℃，衍生

20-240min。结果见图5-2

图5-2 甲砜霉素用衍生化试剂SylonHTP, BSTFA 和 SylonBFT的优化

Fig. 5-2 Optimization of derivatization bySylonHTP, BSTFA and SylonBFT江南大学博士学位论文

78

从图5-2中的结果表明：用SylonHTP做衍生化试剂，需要60 min，但是灵敏度不够

高，而BSTFA 做衍生化试剂，虽然灵敏度提高了，但衍生化时间大约要4h，用SylonBFT

做衍生化试剂，衍生化时间大约1 h，但是灵敏度是SylonHTP的4倍，是BSTFA的2倍。

因此，选择SylonBFT作为衍生化试剂。

5.3.2 仪器分析结果

5.3.2.1 方法的线性范围和相关性

分别以0.45，4.5，9.0，18.0，45.0，90.0，180.0μg/L的标准溶液进样，得工作曲线。

y = 3502.3x - 356.98

R2 = 0.9991

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

0 20 40 60 80 100

浓度（μg/L）

面积峰图 5-3 HP$$lc 标准曲线

Fig. 5-3Standard curve of HP$$lc

y = 3483.8x - 246.97

R2 = 0.9997

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

0 20 40 60 80 100

浓度（μg/L）

面峰积图 5-4 HP$$lc/MS 标准曲线

Fig.5-4 Standard curve of HP$$lc/MS第五章甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化

79

y = 3037.1x - 99.58

R2 = 0.9999

浓度（μg/L）

面峰积图 5-5 gc/MS 标准曲线

Fig.5-5 Standard curve of gc/MS

5.3.2.2 方法的回收率和检出限

添加浓度为 0.1，10，20 μg/kg，甲砜霉素的回收率分别为：HP$$lc 为 78.6～95.4% ；

HP$$lc/MS 为 72.6～99.8%；gc/MS 为 85.6～101.5%，相对偏差均小于 10% 。以信噪

比的三倍为检出限，计算得出三种仪器的检出限分别为：HP$$lc 为 8.3μg/kg；HP$$lc/MS

为 0.1μg/kg；gc/MS 为 0.1μg/kg。

表 5-5 三种仪器不同浓度的检测结果

Tab.5-5 The result of various concentrationby three apparatus

仪器添加浓度

(μg/kg) 平行 平(均%)值 R(%SD)

1 2 3 4 5

0.1 0 0 0 0 0

HP$$lc10 71.8 78.2 85.5 72.9 84.6 78.6 7.4

20 87.4 101.5 99.1 91.3 97.7 95.4 5.9

0.1 69.2 72.9 78.1 68.6 77.2 72.6 4.5

HP$$lc/MS10 89.6 93.1 98.5 97.3 93.4 95.4 3.7

20 96.5 101.5 96.2 102.6 100.2 99.8 2.5

0.1 80.7 89.6 83.6 87.5 88.6 85.6 3.7

gc/MS10 90.8 102.5 93.7 97.1 101.4 97.6 5.0

20 100.8 97.3 105.6 103.8 104.1 101.5 3.4

5.3.2.3 仪器分析方法图谱

1）气相色谱定性、定量检测甲砜霉素

从甲砜霉素高效液相色标准品和加标样品的色谱图可以看出，二者在鱼上的保留时

间是一致的，如果样品中的残留药物是未知的，这种方法不能作为定性的依据，还要通

过别的方法做确证实验。在本实验中，对浓度为 1μg/L 和 2μg/L 的甲砜霉素标准品衍

生物溶液重复进样 10 次，锋面积的相对偏差小于 3% ，符合定量要求。

图 5-7 甲砜霉素标准品的 HP$$lc 图

Fig.5-7 The HP$$lc-spectrogram ofthiamphenicol

图5-8 加标样品的色谱图(10μg/kg)

Fig.5-8 The spectrogram of fortified sample（10μg/kg）

准确称取甲砜霉素阴性鱼肉样品，分别在其中加入不同量的甲砜霉素标准品。

经提取、固相萃取净化、富集衍生化和气相色谱-质谱分析测定来考察检测方法的回

收率，其结果见表 5-5。从结果中可以看出，样品的回收率都比较高，相对偏差都小

于 10%。

2) 气相色谱-质谱定性、定量检测甲砜霉素

甲砜霉素的化学性质比较稳定，熔点比较高，不容易气化，甲砜霉素分子中含有两个羟基，可以通过衍生化以提高其挥发性，用负化学电离源检测，灵敏度较高。

甲砜霉素的衍生化产物以及其衍生物的质谱图见图 5-9。从甲砜霉素衍生物的质谱图

上可以看出， 409、411、499、501 这四个离子特异性较强。在本实验中，对浓度为

1μg/L 和 2μg/L 的甲砜霉素标准品衍生物溶液重复进样 10 次，锋面积的相对偏差小

于 3% ，符合定量要求，因此选择这四个离子作为选择离子。

图 5-9 甲砜霉素衍生物的质谱图

F

图5-10 加标样品的色谱图(10μg/kg)

Fig.5-10 The spectrogram of fortifiedsample（10μg/kg）江南大学博士学位论文

82

准确称取甲砜霉素阴性鱼肉样品，分别在其中加入不同量的甲砜霉素标准品。经

提取、固相萃取净化、富集衍生化和气相色谱-质谱分析测定来考察检测方法的回收

率，其结果见表6。从结果中可以看出，样品的回收率都比较高，相对偏差都小于10%。

3) 液相色谱-质谱定性、定量检测甲砜霉素

在 $$lc/MS 检测方法中，多采用 ESI(-)方式。负离子方式可以提供较正离子方式

更多的碎片信息。本研究采用负离子方式。从甲砜霉素的质谱图上可以看出，除分

子离子峰外，185、240、270、290 这四个离子特异性较强。在本实验中，对浓度为

1μg/L 和 2μg/L 的甲砜霉素标准品衍生物溶液重复进样 10 次，锋面积的相对偏差小

于 3% ，符合定量要求。

图 5-11 甲砜霉素的质谱图

图 5-12 加标样品的$$lc/MS色谱图

Fig.5-12 The $$lc/MSspectrogram of fortifiedsample第五章甲砜霉素残留的仪器检测方法的建立与优化

83

准确称取甲砜霉素阴性鱼肉样品，分别在其中加入不同量的甲砜霉素标准品。经

提取、固相萃取净化、富集衍生化和气相色谱-质谱分析测定来考察检测方法的回收

率，其结果见表5-5。从结果中可以看出，样品的回收率都比较高，相对偏差都小于

10%。

5.4 本章小结

1. 本实验优化了甲砜霉素从生物样本中的分离提取方法，用碱化乙酸乙酯混合液（1

﹕1，v/v）加 3g 硫酸钠作为提取溶剂，振荡提取组分，重复三次，取得了较好

的效果。

2. 样品的净化方法，对于硅胶柱，用20%的乙腈水溶液，50%的二氯甲烷和正己烷的

混合液活化硅胶柱，上样后，用50%的二氯甲烷和正己烷的混合液淋洗，然后用20%

的乙腈水溶液洗脱柱子，甲砜霉素的回收率最高。对于C18柱，用甲醇，水活化柱子，

上样后，用水淋洗，然后甲醇洗脱柱子，甲砜霉素的回收率最高。

3. 对于gc/MS，用SylonBFT做衍生化试剂，衍生化时间大约1 h,但是灵敏度是SylonHTP

的4倍，是BSTFA的2倍。因此，选择SylonBFT作为衍生化试剂。

4. 建立了甲砜霉素的 HP$$lc，HP$$lc/MS，gc/MS 三种检测方法，甲砜霉素的回收率

分别为：HP$$lc 为 78.6～95.4% ；HP$$lc/MS 为 72.6～99.8%；gc/MS 为 85.6～

101.5%，相对偏差均小于 10% 。以信噪比的三倍为检出限，计算得出三种仪器的

检出限分别为：HP$$lc 为 8.3μg/kg；HP$$lc/MS 为 0.1μg/kg；gc/MS 为 0.1μg/kg。

总结与展望

近年来，甲砜霉素在水产养殖中被广泛应用。现在甲砜霉素在欧盟属于受监控药物，

在日本属于被禁用药物。因此，如何控制 TAP 在水产动物内残留成了一个重要问题。

对残留实施监控是一种复杂的系统工程，包括从药物及剂型研制、注册登记、使用、食

品和环境监测等诸多环节。从理论和技术角度，建立最高残留限量和分析方法是最基本

的方面。前者是监控的依据，后者是监控的手段，二者共同构成了兽药残留监控的基础。

近年来，国内对甲砜霉素的检测方法只有气相色谱法，远远不能满足实际监控的需要。

本研究对水产品种甲砜霉素的残留检测方法进行了研究，建立了快速筛选的 ELISA 方

法，同时建立了高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用的方

法。在建立了仪器分析方法的基础上，采用高效液相色谱法，研究了 TAP 在鲈鱼血液

和可食性组织中的消除规律，制定了合理的休药期。

筛选分析法一般提供被测物是否存在或浓度是否超过MRLs的初步信息。对筛选分

析法只要求具有半定量和一定的定性能力，但必须灵敏度高、过程简单、分析速度快。

在此条件下一般不会出现假阴性结果，但假阳性结果的几率必然升高。通常可以认定筛

选分析法的阴性结果，但对阳性结果必须用确证分析法确证。本文建立的ELISA方法用

于水产品中TAP的检测，结果稳定，安全可靠。研究的结果初步显示，该方法是用于水

产品种的TAP残留快速检测。非常适合作为TAP残留的筛选方法。

为降低大批量样品分析的成本和提高分析效率，商检中通常将筛选分析法和确证分

析法组合使用，即所谓“两步”策略：首先用筛选分析法对大量样品进行快速分析；疑

似阳性样品再用确证分析法确证。根据这个原则，在建立了TAP残留的ELISA方法外，

本研究还建立了TAP残留的仪器分析方法，高效液相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联

用的方法的方法可以作为确证方法，明确提供全部或补充的确证信息，避免了假阳性结

果。

在建立各种检测方法的同时，本文还对原有水产品中TAP残留的提取方法进行了研

究改进，对各种影响因素进行了研究，建立了一套高效提取甲砜霉素残留的提取分离净

化方法。甲砜霉素除了在水产养殖中广泛应用之外，在畜禽中也广泛应用，在畜禽中的

残留尚待进一步研究。

应用高效液相色谱法，研究了TAP在鲈鱼体内的消除规律。根据统计学方法，得出

了TAP在鲈鱼用药的休药期。但是药物在水产品中的代谢动力学受很多因素的影响，如

给药方式、种属不同以及水温和化学物质的影响，都能影响到药物在水产动物体内的代

谢。本论文只是研究了TAP在一个温度下在一种鱼类中的代谢消除规律，今后可以在以

下几个方面加深研究：

(1) 同一药物在不同的水产动物体内代谢动力学种属差异性研究；

(2) 研究环境因子(如温度、盐度、溶解氧等) 对水产动物药动学影响；

(3) 比较研究水产动物健康与非健康水平时的药动学,建立人工诱发疾病的水产动物药动学模型；

(4)进一步研究药物在水产动物体内生物转化及代谢产物在水产动物体内的代谢和消除规

律；

(5) 深入开展水产动物药动学与药效学、毒理学的同步研究,全面评价药物在水产

动物体内的效用。

综观全文，TAP 残留的 ELISA 检测方法的研究是涉及多学科多领域的交叉性课题。

它包括生物合成技术，免疫技术，生物标记技术，提取分离净化技术等。本文对这几个

方面都进行了系统的研究，建立了快速简便的 TAP 残留检测技术。酶免疫检测技术最

显著的特点是对酶促反应与免疫反应进行了有机的统一。但是对酶免疫检测动力学的研

究非常少，主要是因为这方面的研究非常复杂。但是如果能够研究清楚了动力学方面的

机理，可能大幅度的提高免疫检测技术的发展，这一方面有待以后研究。主要结论

主要结论

1. 通过酯化反应，合成了 TAP 酯化产物，HP$$lc/MS 鉴定结果表明，获得产物就是应

得的 TAP 酯化产物；利用混合酸酐法合成 TAP-BSA 偶联物，构建 TAP 完全抗原

并进行鉴定。起始的摩尔比和合适的反应溶剂系统是提高偶联比和 TAP-HS 利用率

的主要因素。本实验起始摩尔比为 TAP-HS：载体蛋白 BSA 为 50﹕1，采用二甲基

甲酰胺 DMF 和 PBS（pH8.0）溶液混合系统，所得偶联产物的偶联比为 1﹕12.5 ；

2. 通过免疫兔子，制备的到了抗 TAP 的特异性抗体，并且通过饱和硫酸铵沉淀，DEAE

柱层析和免疫亲和层析法对抗体进行了纯化。通过 ic-ELISA 方法对抗体的效价，

亲和常数和特异性进行了鉴定。抗体的效价达到了 1×106以上，亲和常数为 7.8×

10-9mol/L。抗体除与氯霉素有轻微的交叉反应外，无明显交叉反应；

3. 根据ELISA原理，通过实验，对实验条件行了摸索，选择了适合本研究的酶标板，

通过方阵法，测定了酶标二抗和包被抗原以及一抗的工作浓度分别为1﹕2000，1﹕

4000和1﹕200，建立了TAP在鱼体内残留的免疫检测方法；ELISA方法检测步骤和

使用试剂多，影响因素也就多。根据不同的影响因素对ELISA方法的影响，对这些

参数作了最优化处理，优化后的参数为：包被时间为37℃1h；封闭液选择了pH8稀

释0.2% 的明胶，封闭时间为37℃1h；温育时间为37℃2h；抗体工作液的浓度为

0.2mol/L, pH8.5;Tween-20的浓度为0.05%；二抗的反应时间为20分钟，显色时间为

15分钟；TMB储存液与底物缓冲液比例为1:4（V/V），TAP标液与抗体体积比为70

﹕30（V/V），建立了优化的ELISA检测方法；

4. 经过优化后，用实际样品进行检验，并对本方法进行了评估：灵敏度为 0.06ng/mL;

添加浓度比较低的时候，平行孔间的变异系数相对较大，但都在允许范围内(<15%)，

回收率也比较低。鱼血清的回收率在测定浓度范围内，不管高低，都在 90%以上。

而组织样品的回收率都比较低，特别是 1ng/g 时，更低。这可能是样品处理过程中

损失造成的。除了个别样品，大部分也还在可接受范围内(<20%); 试剂盒所采用抗

体针对 TAP 有交叉反应（TAP100％），抗体对其他抗生素类药物没有交叉反应；板

内 CV 要小于批内和批间 CV，所有 CV%都小于 15%；ic-ELISA 检测与 gc 比较，

检测结果相差重现性好，各个指标都达到了要求。经过保存实验，经过三个月后，

试验的重复性很好，标准曲线重现性好；

5. 建立了甲砜霉素的 HP$$lc，$$lc/MS，gc/MS 三种检测方法，甲砜霉素的回收率分别

为：HP$$lc 为 78.6～95.4% ；HP$$lc/MS 为 72.6～99.8%；gc/MS 为 85.6～101.5%，

相对偏差均小于 10% 。以信噪比的三倍为检出限，计算得出三种仪器的检出限分

别为：HP$$lc 为 8.3μg/kg；HP$$lc/MS 为 0.1μg/kg；gc/MS 为 0.1μg/kg；

6. 鲈鱼单次口服 5 m g/kg 和 30 m g/kg 的 TAP 药物后，药物在血液中的达峰时间分别江南大学博士学位论文

104

为 6 小时和 8 小时，在服药 36 小时以后，血液中的药物浓度还高于要求的最大限

量（50ng/mL），药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系数

是个常数。药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时，从而表明药物的消

除速率不依靠药物剂量的服用的大小；甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级

吸收二项指数方程：C=10.812（e-0.087t – e-0.274t），鲈鱼口服甲砜霉素后，药物在鲈

鱼血液中的吸收半衰期为 1.997h,消除半衰期为 5.589h；连续 5 天口服 15 和

30mg/kg 的 TAP，药物在血液中的浓度和服用剂量有很好的相关性，在可测范围内，

药物的吸收速率是一个常数，它在血液中的消除速率也是一个常数，这和单次口服

结果一致; 其消除速率方程分别为 C血液=0.849e-0.494t ；

C肌肉=1.461e-0.682t，甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为 1.016d 和 1.403d。

7. 通过 EMEA/CVMP/036/95 所规定的统计方法计算休药期，在连续 5d 口服 15mg/kg

和 30mg/kg 的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d 和

6.0d，确定了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期，在休药期以后，

认为是安全的，可以作为食物消费。主要创新点

105

主要创新点

1. 根据ELISA原理，以抗TAP多克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)

为酶标二抗，对实验条件行了摸索，建立了TAP在鱼体内残留的免疫检测方法；根

据不同的影响因素对ELISA方法的影响，对这些参数作了最优化处理，经过保存实

验，经过三个月后，试验的重复性很好，标准曲线重现性好；

2. 建立了甲砜霉素的 $$lc/MS，gc/MS 检测方法，甲砜霉素的回收率分别为 HP$$lc/MS

为 72.6～99.8%；gc/MS 为 85.6～101.5%，相对偏差均小于 10% 。以信噪比的三

倍为检出限，计算得出仪器的检出限分别为： HP$$lc/MS 为 0.1μg/kg；gc/MS 为

0.1μg/kg。

3. 鲈鱼单次口服 5 mg/kg 和 30 mg/kg 的 TAP 药物后，药物在血液中的达峰时间分别

为 6 小时和 8 小时，药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系

数是个常数。药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时；甲砜霉素在鲈鱼

血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程；在连续5d口服15 mg/kg和30 mg/kg

的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d 和 6.0d，确定

了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期。

第六章甲砜霉素残留在鲈鱼体内的消除规律

6.1 引言

6.1.1 药代动力学简介

药代动力学是指导正确使用药物，提高用药合理性与有效性的一门应用基础学科。鉴于水产药物的应用现状，药物代谢动力学及组织动力学在水产业的应用，通过确定药物在动物体内的吸收、代谢、排泄等代谢动力学基本参数，确定药物准确疗程，包括：剂量大小，给药间隔时间长短，给药方法，连续给药次数，以及休药期；为临床用药提供理论依据，有助于指导合理用药，使药物充分发挥疗效又避免或减少副作用的发生。可望从根本上解决上述弊病。根据药动学原理，达到治疗效果的有效血药浓度及有效血药浓度维持时间与药物种类、实验动物（大小、状况）、给药方式都有直接关系，所以，当经过药效学实验确认一种药物为某种病原体的敏感药物后，还必须通过该药物的药动学研究，才能确定合理给药方案。不同动物之间或任意药物之间给药方案或临床应用的随意移植都是违反药动学原理的。近年来，我国科研工作者已经开始重视渔药临床应用及水产药动学研究，中国水产科学研究院黄海水产研究所从1994 年开始受农业部的委托先后进行了“水产养殖防治病药物效果对比筛选试验”和“渔药药代动力学及对环境影响研究”等项目的研究工作，对目前常用渔用药物的药效、毒理及对养殖生态环境的影响等方面内容进行了较深入的研究，现已取得显著成果，对改善渔药应用现状起到积极的促进作用。为迎接入世挑战，国内已逐步开始推行HACCP（危害分析及关键点控制）计划。特别是我国加入WTO 以后，经济贸易需要与世界接轨，各项管理规定必须符合国际要求，才能与世界各国顺利发展贸易关系。然而，近年来频频发生的“贸易壁垒”事件给我国对外贸易造成巨大损失，主要原因在于我国的动物源性食品药物残留超标，使其贸易出口受到巨大压力。药动学原理在水产业的应用，有利于制定正确给药方案，以规范水产动物疾病临床用药；对水产品中药物残留实行有效监控，以保护生态环境、保证食用者健康，杜绝药残超标事件发生；以加快我国实现从传统渔业向无公害渔业的转变及实现水产养殖业的可持续发展。

6.1.2 本章研究的主要目的和主要内容

随着水产养殖业发展，养殖水域污染不断加剧, 导致水产动物的病害问题日益突出。生产中，很多抗菌药物被用来治疗各种水产动物疾病。然而，渔药使用多是凭经验或借鉴人畜的用药方法，具有很大的盲目性,影响了药物的疾病防治效果；另外留降低了水产品的品质，严重威胁着食用者的健康。因此，进行渔用抗菌药物的药动学以及残留研究，具有重大的理论和现实意义。本章主要研究 TAP 在鲈鱼中的代谢和消除规律，确定休药期。主要研究内容：

1）高低两种剂量 TAP 单次口服后在鲈鱼血液中的药时曲线；

2）高低两种剂量 TAP 连续 5 次口服后在鲈鱼血液和肌肉+皮中的消除规律。

6.2 材料与方法

6.2.1 实验材料

6.2.1.1 实验动物

健康鲈鱼（Lateolabras janopicus），平均体重（250±6）g，饲养于实验中心，试验用水为海水，盐度为3.5%，水温（22±3）℃，充气，流水，每日投喂空白混合饲料，用前暂养两周，检验表明试验用于血液和组织无甲砜霉素及其它药物残留。定期检查试验与状态，如果有发病者，剔除并查明原因，选择健康者进行实验。

6.2.1.2 药品及试剂

甲砜霉素(TAP)标准品购于sigma公司，纯度99.99%；甲砜霉素(TAP)原粉购于浙江海翔药业有限公司，纯度99.9%；甲醇、乙腈 色谱纯；乙酸乙酯 化学纯；正己烷 分析纯；双蒸水 实验室自行制备。

6.2.1.3 实验仪器

高效液相色谱仪 Waters2695 美国Waters公司

匀浆机 XHF-1 上海仅达生化仪器厂

台式离心机 TGL-16C型上海安亭科学仪器厂

电子天平 AB104-N 梅特勒-托利多（上海）

超声波振荡仪 SB5200型上海必能超声有限公司

旋转蒸发仪 RF-52型上海亚荣生化仪器厂

6.2.2 实验方法

6.2.2.1 溶液配制

1） 标准溶液配制

精密称取TAP标准品0.0100g，用甲醇溶解，100mL容量瓶定容，配成100μg/mL的母液，4℃冰箱保存。用前，取此母液，用流动相梯度稀释成20、10、5、 2 、1、 0.5、 0.2、0.1、 0.05、 0.02、0.01μg/mL的梯度标准溶液备用。

2） 流动相配制:甲醇/10mmol/L醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有0.1%冰醋酸的比例配制成流动相，4℃冰箱保存。流动相用前均已0.45μm微孔滤膜超滤，超声波脱气。

6.2.2.2 给药与采样

1 ）给药

代谢组：实验前将鲈鱼随机分成9组，分别编号，称重记录后，分到9个鱼缸中，每缸9 尾。TAP原粉用蒸馏水配成1mg/mL混悬液，给药前按编号去受试鱼，用去针头的注射器按15 mg/kg 和30mg/kg 鱼体重单次口服灌胃给药，给药时将注射器插入鱼的喉部，防止药液从鳃部漏出。记录给药时间，各组鱼每条之间给药间隔定为5分钟。

残留组：取1mg/mL TAP混悬液，按15 mg/kg 和30 mg/kg鱼体重连续5天口服灌胃给药，每天一次，具体操作同上。

2） 采样

代谢组：于停药后的1、 2、 4 、6 、8 、10、 16、 24、36 h按编号剖杀采样。取受试鱼，破坏脑脊髓，迅速断尾取血样，同时解剖取背部肌肉、肝脏、鳃组织；用滤纸吸净组织表面的的血液和水。每一时间点各取一组8尾鱼，作为8个平行样品分别处理。另外取数尾未给药的鱼作空白对照。全部样品-20℃冷冻保存用于药物分析。

残留组：于停药后的3小时1、2、4、6、8、10d分别剖杀取样，取受试鱼，破坏脑脊髓，迅速断尾取血样，同时解剖取背部肌肉和鱼皮；用滤纸吸净表面的的血液和水。其余同上。

6.2.2.3 样品处理与检测

1） 样品中TAP的分离提取

称取10.0 g左右经过匀浆的组织样品于50 mL聚四氟乙烯塑料离心管中加入3g 无水硫酸钠, 混合均匀，再加入20mL碱化乙酸乙酯（乙酸乙酯/25%氨水，97+3 V/V），振荡提取10min，5500r/min 离心10 min，分出上清液。连续提取三次，合并提取液,在45-50℃水浴旋转蒸发掉大部分溶剂，剩余溶剂用氮气吹至近干, 用4 mL 乙酸乙酯分两次将提取物转移至另一支试管中，同时弃去不溶物。再次将乙酸乙酯溶液蒸发至近干后，加入4 mL 甲醇溶解提取物，加入4% 的NaCl 溶液，摇匀；再加入正己烷，萃取，弃去正己烷层；向水层中加入乙酸乙酯,振荡,静置分层后,弃去水层; 有机相氮气吹至近干待固相萃取柱进一步净化。

2） 固相萃取净化样品 6 mL硅胶小柱依次用5 mL乙腈、5 mL 体积比为50﹕50的二氯甲烷和正己烷的混合液活化；500 μL二氯甲烷溶解上步中提取液残留物后上样；5 mL体积比为50﹕50的二氯甲烷和正己烷的混合液淋洗，弃去淋洗液；用5 mL的乙腈水溶液洗脱，洗脱液用3mL乙酸乙酯分3次提取，合并提取液并吹干，用5 mL的乙腈水溶液溶解残留物，待C18柱进一步净化。6 mL C18小柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，上样，5mL水淋洗，弃去淋洗液，5 mL甲醇洗脱，吹干洗脱液。

3） 色谱条件

色谱柱：XTerra? MS C18 5μm， 4.6 × 250mm。色谱条件流动相为甲醇/10mmol/L 醋酸銨水溶液（20+80，V/V），含有 0.1%冰醋酸，流量 1 mL/min；柱温 30℃；进样量 20μL。检测器：二极管阵列检测器，检测波长为：224nm。

4 ）回收率（recovery）测定

空白组织中加入浓度为0.05、0.5、5、20μg/mL的TAP标准液，放置2小时，使药物充分渗入组织，按样品处理方法处理后测定，所得峰面积平均值与上述标准液直接进样测得的峰面积平均值之比值，即为药物的提取回收率。

5）精密度（precision）

将上述TAP的四个浓度样品与一天内分别重复进样5次和分5天测定，计算四个浓度水平响应值峰面积的变异系数（C.V%）和平均变异系数（C.V %），以此衡量定量方法的精密度。

6） 检测限（Limit ofdetection ，LOD）

取空白样品，按样品处理程序处理后测定，另外将空白组织制成低浓度的药物含量的含药组织，预处理后测定，对比二者，将引起2～3倍基线噪音的药物浓度定义为最低检测限。

7 ）标准曲线与线性范围（linearrange）

取空白组织，加入标准溶液配制的梯度标准液，静置一段时间后，按样品处理方法处理后进样，每个人浓度水平重复三次，以浓度为纵坐标，以峰面积为横坐标作标准曲线，并求出回归方程和相关系数。以此估计样本中的TAP的线性范围。

6.3 结果与讨论

6.3.1 TAP 的色谱行为

进行药物动力学及残留研究当前多采用高效液相色谱法进行样品分析。由于生物样本的特殊性，对其中的药物分析对分离提取条件有特殊要求。液相色谱分析中，大多数样品的基质及成份组成相当复杂，大量性质未知的组分以无法预料的方式影响分析过程，尤其在残留分析中待测物质仅痕量存在，有时待测组分不确定。因此生物样品在分析前先要对样品进行预处理，以排除干扰，增加检测的灵敏度和选择性，使其符合所选分析方法的要求。在本实验建立的色谱条件下，样品进行HP$$lc分析，基线走动平稳，药物峰与杂质峰分离良好。

6.3.2 TAP 回收率

回收率是反映从制备样品到测定等各环节误差大小及间接反映测定准确度的一个指标。各组织中药物回收率见表6-1。由表中可以看出，各组织中TAP高低浓度回收率都比较高，达到85%以上，而且比较稳定。表明实验方法可行。

表6-1 组织中TAP的回收率

Tab.6-1 Recovery rate of TAP in tissues

样本浓度（μg/mL）回收率（n=5）X ±SD

肌肉+皮        血液

0.05                90.32±2.63        85.69±1.78

0.5                  92.53±2.18        87.53±2.12

5                    93.24±1.95          88.65±1.85

10                    90.16±2.14        89.16±1.92

平均回收率%            91.56±2.23          87.75±1.92

6.3.3 精密度

组织中 TAP 四个浓度（0.05、0.5、5、20μg/mL）的日内及日间变异系数（C.V%）及总平均变异系数（C.V %）见表 6-2。该指标可反映生物样品从制样、保存到检测各环节的总误差，是评价测定方法准确度的标准之一。要表中可以看出，血液及组织中药物的测定结果较稳定，说明本实验方法可靠。

表 6-2 组织中 TAP 进行 HP$$lc 分析的变异系数

Tab. 6-2Precision of TAP in tissues by HP$$lc

组织样品药物浓度（μg/mL）日内变异系数（C.V%）日间变异系数（C.V%）

0.05                2.86                      3.59

0.5                    2.14                      3.13

5                    1.83                      2.54

10                  1.17                1.95

肌肉+皮C.V % 2.00±0.86 2.80±0.85

0.05 3.63 4.82

0.5 3.01 3.83

5 2.26 3.01

血液

10 1.82 2.34

C.V % 2.68±0.95 3.50±1.32

6.3.4 标准曲线及线性范围

按照标准曲线的做法，以相应浓度 Ci 对测得的各平均峰面积作线性回归，制作标准曲线，TAP 在组织的标准曲线回归方程及相关系数见表 6-3。标准曲线见图 6-1，6-2。

线性范围 0.015～30μg/mL（n=5）。由相关系数知，在标准曲线的线性范围内，HP$$lc测定线性良好，此标准曲线可用于准确定量。

表 6-3 组织中 TAP 的标准曲线方程及相关系数

Tab.6-3 Standard curve equations andcoefficients of TAP in tissues

样本标准曲线回归方程相关系数

肌肉+皮 Y=3639.2X－2356.1 0.9997

血液 Y=3099.6X－1986.4 0.9991

y = 3099.6x - 1986.4

R2 = 0.999

0

20000

40000

60000

80000

100000

0 5 10 15 20 25 30 35

浓度（μg/mL）

面峰积图 6-1 TAP 在肌肉+皮中的标准曲线

Fig.6-1 Standard curve of TAP in muscle

y = 3639.2x - 2356.1

R2 = 0.9997

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 5 10 15 20 25 30 35

浓度（μg/mL）

面峰积图 6-2 TAP 在血液中的标准曲线

Fig.6-2 Standard curve of TAP in plasma江

6.3.5 最低检测线

在本实验条件下，组织中 TAP 最低检测限为 0.01μg/mL。6.3.6 鲈鱼单次口服 TAP 后体内组织中药物浓度鲈鱼单次口服 15 和 30mg/mLTAP 后，不同采样时间血液中药物浓度见表 6-4；表 6-4 鲈鱼单次口服 15 和 30m g/kg TAP 后在组织中药物浓度（ X ±SD）

Tab.6-4 Tissue levels(mean±s.d.)of TAP inLateolabras j anopicus after single oral administration at

a dose of 15and 30m g/kg

时间（小时）血液中 TAP 浓度（μg/mL）

15mg/kg 30mg/kg

1 0.59±0.32 0.88 ±0.28

2 1.82±1.13 3.64±1.98

3 4.19±2.15 5.37±0.91

4 4.46±1.36 5.10±0.45

6 6.31±0.91 6.03±0.63

8 5.19±0.49 10.21±0.86

12 5.55±0.26 7.01±0.76

24 0.71±0.16 0.78±0.16

36 0.66±0.08 0.66±0.1

TAP 在鲈鱼血液内的药物浓度-时间曲线图见图 6-3

AP在T液血的中度浓Lμg/m（） 15mg/kg30mg/kg

图 6-3 鲈鱼单次口服 15 和 30mg/kgTAP 的药-时曲线Fig.6-3 The concentration-time curve of TAP in Lateolabras janopicus aftersingle oral administration at a dose of 15 and 30m g/kg第六章 甲砜霉素残留在鲈鱼体内的消除规律

表 6-5 鲈鱼单次口服 15 和 35mg/kg TAP 的药代动力学参数Tab.6-5 Pharmacokinetic parameters of TAP after single oraladministration at a dose of 15 and

30m g/kg in Lateolabras j anopicus

参数血液

15mg/kg 30mg/kg

Cmax (μg/mL) 6.31 10.21

Tmax (h) 6 8

AUC0 36 (μg·h/mL) 58.0 102

MRT0 36 (h) 11.9 11.1

Cmax:单剂量给药在血液中出现的高峰；Tmax：单剂量给药在血液中出现的高峰的时间；AUC0 36：药物浓度-时间曲线下的面积。MRT0 36：平均滞留时间。

峰浓度 Cmax 和达峰时间 Tmax 等是衡量药物在体内吸收速度和程度的重要参数。由药时曲线可以看出，鲈鱼口服高剂量和低剂量的 TAP 药物后，吸收比较缓慢。服用高剂量的 TAP 以后，在血液中的达峰时间为 8 小时，明显低于低剂量的达峰时间 6 小时。这可能是提高剂量后。对药物的吸收有轻微的延缓作用。在服药 36 小时以后，血液中的药物浓度还高于要求的最大限量[1]（50ng/mL）。数据表明，单次口服药物后 2～3 天的鲈鱼不能作为人消费的食物。当用峰浓度 Cmax 和药物浓度-时间曲线下的面积AUC0 36 与所服药物的剂量 D 相除即：Cmax/D ，AUC0 36 /D 时，其结果分别为：高剂量为 0.42 μg/mL ，3.87μg·h/mL；低剂量时为：0.34 μg/mL ，3.4μg·h/mL。从结果可以看出，当服用高剂量和低剂量药物时，二者的结果很相似。这表明药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系数是个常数。MRT0 36平均滞留时间的数值高剂量时为 11.1 小时，低剂量时为 11.9 小时，从而表明药物的消除速率不依靠药物剂量的服用的大小。

甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程：C=10.812（e-0.087t–e-0.274t），鲈鱼口服甲砜霉素后，药物在鲈鱼血液中的吸收半衰期为 2.529h，消除半衰期为 7.966h。

Mazzolini 等[2]在 997 年的研究中发现，药物TAP 对鱼类中两种很重要的病原体Vibrioanguillarum 和 Photobacteria damsela var.piscicida 的最小抑制浓度（MIC50 ）分别为 2.5μg/mL 和 5 μg/mL 。本实验中，单次口服高剂量的 TAP 药物，它在体内血液中的浓度能超过 5 μg/mL 的时间间隔为 12 小时，服用低剂量的 TAP 药物，它在体内血液中的浓度能超过 2.5 μg/mL 的时间间隔为 12 小时。这个浓度足够抑制病原体的发作。

6.3.7 TAP 在鲈鱼体内的消除规律

表 6-5 鲈鱼连续口服 15 和 30 mg/kg TAP，第 5 次给药后的组织药物浓度（ X ±SD）Tab.6-5 Concentrations (mean±s.d.)of TAP in L ateolabras j anopicusafter the fifth of oraladministration of 15 and 30 m g/kg for five consecutivedays

时间（d）

血液中 TAP 的浓度（μg/mL）

肌肉+皮中 TAP 的浓度（μg/g）

15m g/kg 30m g/kg 15m g/kg 30m g/kg

0.125 0.74±0.07 1.34±0.35 0.93±0.161.48±0.23

1 0.67±0.05 0.75±0.29 0.62±0.15 1.21±0.19

2 0.23±0.02 0.35±0.21 0.09±0.05 1.05±0.10

4 0.08±0.01 0.12±0.02 0.03±0.01 0.06±0.01

6 ND ND ND ND

8 ND ND ND ND

10 ND ND ND ND

ND：低于检测线

连续 5d 口服给药后，甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的浓度随时间变化见表 6-5，经过非线性最小二乘法回归处理后，血液几个组织的药物浓度与时间关系的消除曲线方程可用下述数学表达式描述：

C血液=0.849e-0.494t ；C肌肉=1.461e-0.682t

连续 5d 口服给药后，甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为 1.016d和 1.403d。

AT在肌P+皮中肉度浓）μg/g（ 15mg/kg30mg/kg

图 6-5 连续 5d 给药后 TAP 在鲈鱼血液中的浓度变化

Fig.6-5 The Concentrations (mean±s.d.)ofTAP in plasma after the fifth of oral administration of 15

and 30m g/kg for five consecutive days

图 6-6 连续 5d 给药后 TAP 在鲈鱼肌肉+皮中的浓度变化

Fig.6-6 The Concentrations (mean±s.d.)ofTAP in muscle+skin after the fifth of oral administrationof 15 and 30m g/kg forfive consecutive days时间（day）浓（度g/g)n95%忍受区间

95%置信区间

图 6-7 15 m g/kg 连续给药后 TAP 在鲈鱼组织中的消除曲线

Fig.6-7 Elimination curve of TAP in Lateolabras j anopicus after the fifth multiple oral

administration of for five 15 m g/kgconsecutive days

时间（day）

AP在血液T浓度（中g/mL）μ15mg/kg30mg/kg江南大学博士学位论文

浓（度g/g）n95%忍受限95%置信区间最大残留量

图 6-8 30 m g/kg 连续给药后 TAP 在鲈鱼组织中的消除曲线Fig.6-8 Elimination curve of TAP in L ateolabras j anopicus afterthe fifth multiple oraladministration of for five 30 m g/kg consecutive days

在本研究中，连续 5d 口服 15 和 30 mg/kg 的 TAP，药物在血液中的浓度和服用剂量有很好的相关性，数据表明，在可测范围内，药物的吸收速率是一个常数，它在血液中的消除速率也是一个常数，这和单次口服结果一致。

Dlla Rocca 等[3] 在 1997 年的研究中发现：连续 5 天服用 40 mg/kg 的 TAP，药物在肌肉中的浓度和达到1.97μg/g，药物在肌肉中的浓度低于 0.03μg/g 时，需要停药后 72小时。在本研究中，连续 5d 服用 30 mg/kg 的 TAP，药物在肌肉中的浓度和 Dlla a Roccaet al 的研究结果相似，但是药物的消除时间更慢。比较慢的消除速率导致了休药期 5 天（低剂量）和 6d（高剂量）明显比 Dlla Rocca et al 推荐的 3d 要长。

在本研究中，休药期是通过EMEA/CVMP/036/95所规定的统计方法[4]，而Dlla Roccaet al 所用的是选择方法。统计学方法是首选的计算休药期的方法，因为在鱼体动力学研究中，个体之间有很大的差别，为了保护消费者的安全，建立一个忍受限是非常重要的。

在连续 5d 口服 15mg/kg 和 30mg/kg 的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d 和 6.0d，因此分别选择了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期，在休药期以后，认为是安全的，可以作为食物消费。

6.3.8 影响药物代谢和残留的因素

1）温度

一般认为药物在组织中的消除速率主要有环境温度决定。在一定温度范围内,鱼体的代谢速率与水温成正比。温度升高 1℃,鱼的代谢活力增加 10% 。Namdari 等[5] 的研究表明,大鳞大麻哈鱼在 15℃和 9℃的最终持续消除率β值大约相差 60% 。Tyrpenou 等[ 6] 研究现, 25℃与 18℃水温相比，沙拉沙星在金头鲷肝脏和肌肉(带皮) 中的最高浓度明显较高，并且消除较快。Namdari 等[7]研究大鳞大麻哈鱼肌肉中 OTC 的分布和消除是消除时测得，水温在 12℃和 9℃下，肌肉中的 OTC 半衰期分别为 10.34 天和 13.59 天，差异明显。因此水温较低时停药期应该适当延长。

2）盐度

不同学者在盐度对药动学的影响方面看法不一。Hugtredt 等[8] 通过实验证明虹鳟在海水中代谢消除率较高,对药物的吸收与分布更快,在淡水中的表观分布容积比海水中略大。Noriko 等[9] 研究发现海水中虹鳟对于恶喹酸的消除明显较淡水中快。而 Abedini等[10] 研究得出盐度相差 24 并未对土霉素的吸收与消除造成较大影响，并且提出可以用淡水中的虹鳟作为一个模型，来研究海水中的虹鳟对土霉素的药物代谢情况，反之亦可。

3) 溶解氧(DO )及其他

对于 DO 对药动学的影响,有学者[11] 认为, DO 高,鱼类行为活跃，代谢旺盛；药物的吸收与分布速率加快,生物利用率也较高,综合药效较好。对于四环素类药物，由于易与二价或三价阳离子结合，水的硬度也影响到药物的吸收与代谢。当给鱼口服喂药后,药物不可避免地与水体中或鱼体内的 Ca2+ 、Mg2+ 以及 AL3+ 螯合,结合后的药物不易穿过细胞脂膜，吸收是不可能的，因此导致药物吸收的缓慢和不完全，消除速度也很慢。

4) 饵料因素

Hustvedt 和 Martinsen 等[ 12, 13, 14] 曾指出，口服药物的载体、投饵给药以及药物和饵料的结合方式,可能会改变峰浓度和达峰时间。例如饵料中的 Ca2+ 、Mg2+ 、Fe2+ 和AL3 + 等离子影响四环素类药物的吸收,并降低其生物利用度。

国外学者在水产动物药动学方面已作了较广泛、深入的研究,而国内则刚刚起步,在广度和深度上均远落后于国外。借鉴国外水产动物药动学研究方法与经验,对提高我国水产动物药动学研究水平十分必要。药动学的特征参数,如吸收速率、达峰时间、峰浓度、分布和消除半衰期、曲线下面积和总体清除率等是选择药物种类、制定用药剂型、剂量和用药周期以及确定休药期的重要依据，为药物的科学使用和水产品安全监控与管理提供理论指导,确保我国水产养殖业持续、健康、稳定发展。由于条件的限制，本论文只是研究了 TAP 在一个温度下在一种鱼类中的代谢消除规律，今后可以在以下几个方面加深研究： (1) 同一药物在不同的水产动物体内代谢动力学种属差异性研究； (2)研究环境因子(如温度、盐度、溶解氧等) 对水产动物药动学影响； (3) 比较研究水产动物健康与非健康水平时的药动学, 建立人工诱发疾病的水产动物药动学模型；(4) 进一步研究药物在水产动物体内生物转化及代谢产物在水产动物体内的代谢和消除规律；

(5) 深入开展水产动物药动学与药效学、毒理学的同步研究,全面评价药物在水产动物体

内的效用。

6.4 本章小结

1. 本章研究了样品中 TAP 的提取净化方法，分离提取简单，样品净化比较彻底，回收率都达到 85%以上，并且比较稳定；高效液相色谱分析谱峰分离良好，灵敏专一，表明此方法是可行的；

2. 鲈鱼单次口服 5 mg/kg 和 30 mg/kg 的 TAP 药物后，药物在血液中的达峰时间分别为 6 小时和 8 小时，在服药 36 小时以后，血液中的药物浓度还高于要求的最大限量（50ng/mL），药物在胃与肠道中的滞留时间不随剂量的大小而变化，吸收系数是个常数。药物平均滞留时间的分别为 11.1 小时和 11.9 小时，从而表明药物的消除速率不依靠药物剂量的服用的大小；甲砜霉素在鲈鱼血液中的经时过程符合一级吸收二项指数方程： C=10.812（e-0.087t – e-0.274t），鲈鱼口服甲砜霉素后，药物在鲈鱼血液中的吸收半衰期为 1.997h，消除半衰期为 5.589h；

3. 连续 5d 口服 15 和 30m g/kg 的 TAP，药物在血液中的浓度和服用剂量有很好的相关性，在可测范围内，药物的吸收速率是一个常数，它在血液中的消除速率也是一个常数，这和单次口服结果一致，其消除速率方程分别为

C血液=0.849e-0.494t ；

C肌肉=1.461e-0.682t，

甲砜霉素在鲈鱼血液和组织中的的消除半衰期分别为 1.403d 和1.016d。

4. 通过 EMEA/CVMP/036/95 所规定的统计方法计算休药期，在连续 5 天口服 15 mg/kg和 30 mg/kg 的 TAP 药物后，95 %的忍受限和最大残留限量的交叉点分别为 4.7d和 6.0d，确定了 5d 和 6d 分别作为服用低剂量和高剂量药物的休药期，在休药期以后，认为是安全的，可以作为食物消费。