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酶联免疫定量测试盒法测黄曲霉毒素B1的方法探讨
摘要:本文主要通过pH值、阳离子(如Cu2+、Fe3+等)、溶液呈色(如红曲)来探讨酶联免疫测试盒法测黄曲霉毒素B1时对样品的提取方法为什么用甲醇水溶液提取会出现假阳性,干扰测定,必须进一步用三氯甲烷来提取黄曲霉毒素B1以消除干扰。关键词:pH值 阳离子 溶液呈色 黄曲霉毒素B1 假阳性黄曲霉毒素B1是剧毒物质,具有极强的致癌性和致突变性。人或动物在食入被AFB1污染的的食品或饲料后,经新陈代谢作用,就会转变为黄曲霉毒素M1、P1等物质,从而影响人类健康。因此世界各国高度重视黄曲霉毒素B1的控制和检测。一、实验1、试剂及仪器:黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒、甲醇水溶液(1+1)、三氯甲烷、ELISA-95型酶标仪、酸度计、微量移液枪2、溶液2.1、pH值为2.2,3.0,、4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,12.0的磷酸盐缓冲液2.2、Cu2+溶液:0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0(mg/mL)2.3、Fe3+溶液:0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7(mg/mL)2.4、红曲水溶液3、实验方法3.1、样品提取液3.1.1、取5克试样,精确至0.01克,于50mL磨口试管中,加入1:1甲醇水溶液25.0mL,加塞振荡10分钟,过滤,充去初滤液,再收集试样滤液。根据所测样品的不同限量值用黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒中的A试剂作为稀释剂进行适当稀释,为待测试液。3.1.2、如果按3.1.1方法提取的样品待测试液呈阳性的结果或有颜色而干扰测验定时,应再用三氯甲烷对3.1.1中试样滤液依下列步骤进行提取。准确吸取10.0mL滤液(相当于2克样品)于125mL的分液漏斗中,加入15mL三氯甲烷,加塞振荡3分钟,静置分层(如有乳化现象可滴加甲醇促使分层)。放出三氯甲烷层,经盛有约10克预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于50mL蒸发皿中,再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中,重复振摇提取2次,三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中,最后用少量三氯甲烷洗过滤器,滤液滤于蒸发皿中。将蒸发皿放入通风橱,65℃水浴通风挥干。准确加入10.0mL1:1甲醇水溶液,将凝结物充分溶解,根据所测样品的不同限量值用黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒中的A试剂作为稀释剂进行适当稀释,为待测试液。3.2、样品测定从冰箱中取出黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒,平衡至室温。用1.5mL酶标稀释液D试剂稀释冻干酶标抗原,制成实验用酶标抗原溶液为C试剂;准备好洗涤液。用洗涤液洗板2次,拍干。选择两孔分别加入50μLAFB1阴性对照液(0.1ng/mL),50μLAFB1阳性对照液(1ng/mL)进行限量分析,(若要作标准曲线定量分析,则选择数孔分别加入AFB1系列标准溶液),其余孔中各加入50μL待测样品提取液,再加入50μL酶标抗原溶液于各孔中;加入50μLA试剂,再加入D试剂50μL作为空白孔,摇匀。37℃孵育30分钟。甩干,涤洗5次,拍干。往各孔中分别加入50μL基质液和50μL显色剂,37℃显色15分钟,如果颜色显色较浅,可适当延长显色时间。观察各孔的颜色与阴、阳性孔的蓝色比较,要进行定量分析,则往各孔中分别加入50μL终止液,并在酶标仪450nm波长处测定各孔吸光度值A。3.3实验结果实验结果见表1:标准曲线各点数值及图1:黄曲霉毒素B1标准曲线方程表1 标准曲线各点数值编号 | ng/ml |
吸光度A值 |
1 | 0 |
2.101 |
A*100/A0 |
lgC |
2 | 0.1(阴性孔) |
1.738 |
82.72 |
-1 |
3 | 0.25 |
1.397 |
66.50 |
-0.602 |
4 | 0.5 |
0.872 |
41.50 |
-0.301 |
5 | 1.0(阳性孔) |
0.612 |
29.13 |
0 |
6 | 2 |
0.305 |
14.52 |
0.301 |
波长 |
450nm |
黄曲霉毒素B1标准曲线方程二、干扰分析1、pH值对ELISA测定的影响将pH值为2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,12.0的磷酸盐缓冲液作为试样分别按3.1.1和3.1.2处理后进行ELISA测定;所得的结果见图2:pH值对ELISA测定的影响。▲阴性线 ■阳性线 ○有机相三氯甲烷提取液 ◆pH缓冲液试液图2 pH值对ELISA测定的影响
从图可以看出,样品提取液的pH值对结果影响很大。当pH值小于5值,结果显假阳性;从图中也可知,采用有机相三氯甲烷萃取时,样品提取液的pH值对ELISA测定的影响得以消除。2、重金属离子(如Cu2+、Fe3+等)对ELISA测定的影响从图3、图4可以看出, Cu2+铜离子对ELISA测定有一定的影响,当Cu2+铜离子浓度超过0.6mg/mL时,结果显假阳性,当Cu2+铜离子浓度超过1.0mg/mL时,曲线变得平缓,即Cu2+铜离子对ELISA的影响趋于恒定;当Fe3+浓度超过 0.1mg/mL时,对ELISA测定的影响显著增强,Fe3+浓度为 0.3mg/mL以上时,测定结果呈假阳性。饲料(特别是浓缩料)、复杂成分的食品等添加了很多的微量元素、化学物质,当用甲醇水溶液(1+1)提取黄曲霉毒素B1出现假阳性时,须用三氯甲烷有机相进一步提取。 ▲阴性线 ■阳性线 ○有机相三氯甲烷提取液 ◆铜离子溶液试样图3 铜离子浓度对ELISA测定的影响▲阴性线 ■阳性线 ○有机相三氯甲烷提取液 ◆铜离子溶液试样图4 铁离子浓度对ELISA测定的影响
3、呈色溶液用甲醇水溶液(1+1)来提取有色物质(如红曲粉等)的黄曲霉毒素B1时,颜色会残留在甲醇水溶液(1+1)相中,从而干扰颜色的分析判断,进一步用三氯甲烷提取黄曲霉毒素B1时,可消除干扰。三、讨论1、pH的影响pH值对ELISA测定的影响机理很复杂,较多的是集中在对酶及催化底物的影响。当pH值低于5时,酶标抗原中的酶的结构发生不可逆的变化并丢失大部分活性,导致显色反应时颜色偏浅,使结果出现假阳性。2、重金属的影响重金属对ELISA测定的影响归根结底是对酶标抗原中酶的影响。这些物质主要与酶蛋白的巯基以共价键结合,甚至还能和羟基、氨基和吲哚基结合,酶被修饰而失活。重金属对酶的抑制作用随着重金属离子浓度的增加而增加;若重金属离子的量足以结合所有的酶,则将出现完全抑制,即酶分子与重金属离子完全生成不可分解的络合物,无法催化底物显色,造成颜色偏浅而显阳性结果。四、总结甲醇水溶液毒性小,价格便宜,用其来提取黄曲霉毒素B1更有利于实验人员的操作安全。只有当用甲醇水溶液测黄曲霉毒素B1出现假阳性、有颜色干扰时,再用三氯甲烷来进一步提取,其毒性相对于甲醇来说更大,价格高,但其极性比甲醇大,可将黄曲霉毒素B1从甲醇水溶液层转移到三氯甲烷层,而干扰物质(如pH、Cu2+、Fe3+、呈色物质等)仍留在甲醇水溶液层,从而消除了干扰。参考文献
1、 江苏省微生物研究所编,黄曲霉毒素B1酶联免疫定量测试盒操作说明书2、 GB/T5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定方法 3、 赵晓联,赵春城等,酶联免疫吸附法测定黄曲霉毒素B1误差分析[J],中国卫生检验杂志,2001,11(4)473~475