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主题：【分享】原代培养及其操作步骤

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发表于：2011/04/21 09:43:37 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。其操作步骤如下。

1. 剪切组织　先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。

2. 消化分离　消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。

3. 培养　细胞悬液用计数板进行细胞计数。用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。
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2011/4/21 9:44:05 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
4. 注意事项

（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。

（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。

（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。

（4）胶原酶溶液：必须新鲜配制，贮存时间过长(即使是-20℃低温保存)，也将影响消化效力，导致消化时间过长，细胞损伤增加。

（5）L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞会因生长不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时，就应重新加入原来量的谷氨酰胺。

（6）静置培养：原代细胞在消化分离后，置于CO2培养箱的头24～48h(必要时72h)内，应处于绝对静置状态，切忌不时地取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁，更谈不上伸展和增殖，初学者尤应注意。不必担心培养液中的营养成分会消耗光，在细胞增殖之前对营养的要求并不大。原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展。

（7）消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可，因为此时组织颗粒已经松散，略经吹打即成细胞团或单个细胞，过久的消化往往导致细胞损伤加重，细胞培养成活率降低。

（8）其他生长因子：经过以上处理，一般原代分离细胞培养均可以成功。对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子，如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸。另外，内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用，但费用较高。
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2011/4/21 9:44:36 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原代细胞培养成功以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养。传代细胞允许培养的细胞扩增(形成细胞株)，可以进行细胞克隆，易于保存，但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征。传代细胞形成细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料，便于实验。

1. 操作步骤

（1）吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液。

（2）向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆盖培养瓶底为宜。

（3）置37℃孵箱或室温（25℃温度）下进行消化，2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即中止消化。

（4）吸出消化液，向瓶内加入Hanks液少量，轻轻转动培养瓶，把残留消化液冲掉，然后再加培养液。如果仅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培养液，终止消化。

（5）使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔，以防用力过猛损伤细胞。

（6）用计数板计数后，分别接种于新的培养瓶中，置CO2培养箱中进行培养。

（7）细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定。一般2～3d后应换一次生长液。待细胞铺满器皿底面，即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液。
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2011/4/21 9:45:20 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
细胞接种或传代以后，实验者每天或至多间隔1～2d，要对细胞做常规性检查。观察细胞形态和生长情况以及培养的pH变化、有无污染等。根据细胞动态变化，做换液或传代处理，如发现异常情况应及时采取措施。

1.细胞形态　生长状态良好的细胞，在一般显微镜下观察时可见，细胞透明度大、折光性强、轮廓不清。细胞生长不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点，如上皮细胞变成类上皮细胞等。某些染料当细胞死亡时能透过变性的胞膜与解体的细胞核DNA结合，而令其着色。因而常用台盼蓝(trypan blue) 鉴别细胞死活，活细胞不着色，死细胞核呈蓝色。

2.细胞生长　初代培养或传代的细胞悬液接种以后，经过长短不同的潜伏期后开始增殖。传代细胞系、胚胎组织或幼体组织一般在第二天即可见细胞生长，一周内便可连接成片。接种细胞长满瓶壁后，应及时做再培养。否则由于营养物消耗和代谢积累，细胞即进入停止期或退化期。此时细胞轮廓增强，细胞内常出现颗粒状堆积物，为膨胀的线粒体，细胞质呈空泡化，细胞变圆、粗糙，严重时细胞从瓶壁脱落，只有及时再做传代处理，才能使细胞继续生长繁殖。
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2011/4/21 9:46:14 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
3.营养液　正常情况下，培养液呈桃红色。如果细胞维持在pH6.5～6.6条件下，细胞会脱落死亡。当培养液酸化变黄时，说明培养液中代谢产物已堆积到一定量，需要更换新鲜培养液。培养液中如加Hepes或用5％CO2温箱培养可使pH维持相对稳定。更换营养液的时间，可依营养物的消耗而定，细胞生长旺盛时2～3d换一次，生长缓慢时，3～4d亦可。要特别注意各种细胞对pH值要求是不一样的。

4.微生物污染　微生物污染培养细胞培养物后会出现pH值改变，培养液呈现混浊状。细菌感染后，由于细菌的运动，光镜观察可见有微闪光；真菌感染则在镜下见许多细丝状菌丝，有时还密集有群集孢子；支原体的污染需要借助一些检测手段才可检出。细胞污染以后一般应当废弃，对于重要的细胞株，可以参考相关专著，介绍采取一些措施清除污染。比较重要的实验、珍贵的细胞，至少由两个实验人员独立培养操作，或由一个人分次(不同时)操作。除培养实验室的卫生条件外，空气中的湿度与微生物污染关系密切。重要的、周期长的实验尽量安排在空气湿度低的秋冬季进行。
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2011/4/21 9:46:51 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
细胞培养的基本技术


取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀释后，沿试管壁慢慢加入4ml淋巴细胞分离液之表面，勿与分离液混合。然后2000r/min水平离心20min，管内分4层，自上而下依次为血浆、单个核细胞(位于细胞分离液上界与血浆下界的中间呈白色雾状层)、颗粒白细胞(位于淋巴细胞分离液下界与底层红细胞上界的交界处)和红细胞(位于管底)。用毛细吸管沿管壁轻轻吸出的淋巴细胞层。然后用Hanks液洗两次，每次2000r/min离心10min，最后计数供用。
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2011/4/21 9:47:21 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一、清洗

新采用和重新使用的培养器皿，都要严格清洗，以防各种有害物质对培养细胞损害。培养用的塑料器皿目前主要依靠进口，均已无菌密封包装，可直接使用。对于塑料瓶盖或胶塞等，可水中浸泡后用2％NaOH煮沸10～20min，自来水中浸泡和蒸馏水漂洗2～3次，晾干备用。细胞培养中的绝大部分器皿系玻璃制品，清洗过程为以下步骤。

1. 浸泡　新使用或重复使用的玻璃器皿须经5％盐酸溶液或自来水浸泡过夜或煮沸30min，水洗。以去除新购进玻璃器皿所带有灰尘、铅、砷等物质，并消除其弱碱性。

2． 刷洗　浸泡后用软毛刷和优质的洗洁精进行刷洗。

3． 酸浸　刷洗后的玻璃制品酸浸前须适当晾干或烘干，以免造成酸浸液稀释，影响效果。将玻璃制品完全浸泡入清洁液中24h。清洁液具有极强酸蚀作用，操作过程需戴防护用具。

4． 冲洗　浸酸后的玻璃器皿先用自来水充分冲洗，吸管需冲洗10min，器皿需每瓶灌满自来水、倒掉反复10次以上，不留任何酸浸液残迹，然后用蒸馏水漂洗2～3次，烘干备用。要求干净透明，无油烟，不能残留任何有害物质及化学药品等。
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2011/4/21 9:59:07 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、消毒

1. 包装　器材经清洗烤干或晾干后，先应严格包装，然后再行消毒灭菌处理，以防止消毒灭菌后再次遭受污染。包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。

2. 消毒　消毒灭菌随物品的不同，而采用不同的方法。

（1）紫外线：主要用于消毒实验室空气、工作台面和一些不能使用其他方法消毒的培养器皿。进无菌室前或做完实验后，均应开灯照射30min进行消毒。紫外线照射60min可以消灭空气中大部分细菌。

（2）消毒剂：操作者的皮肤、培养瓶的盖和外壁常用碘酒、酒精消毒。无菌室内桌椅和物体的消毒可用0.1％新洁尔灭、过氧乙酸、来苏儿等擦拭或浸泡。实验室、无菌室的消毒可用甲醛熏蒸（高锰酸钾5～7.5g，加40%甲醛10～15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，房间密闭24h即可）。

（3）干热消毒：多用于玻璃器皿消毒，干热烤箱180℃45～60min。

（4）湿热消毒：培养液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa（115℃）高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa（121.3℃）高压灭菌15～20min。

（5）滤过消毒：用孔径200～450nm大小的滤板可除去培养液和试剂中的细菌和霉菌等。用200nm孔径的滤板通过两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。滤器分为负压和加压式两种。过滤的液体量很少时，可选用注射器微量滤膜滤器。

（6）60Co照射：不耐热的塑料制品或一次性用品的灭菌可经包装后，用γ射线照射消毒。
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2011/4/21 10:01:43 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
三、无菌操作

无菌操作是防止污染、决定培养是否成功的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。工作前对手部需清洗消毒，进无菌操作室时戴口罩和穿工作服。不能用手直接触及已消毒器皿内部。打开培养瓶前或封闭瓶口前须火焰烧灼瓶口等。

四、取材

取材应注意无菌操作，防止污染。污染组织应放入含两性霉素B（2μg/ml）、青霉素（500u/ml）、链霉素（500μg/ml）的培养液中浸泡10～20min。取材后应立即进行培养。如因故不能培养时，应在无菌条件下，把组织块切成1cm3大小置于培养液中37℃贮存。存放时间不宜超过24h。

1． 源自人体的肿瘤和其他病理组织的取材、贮存和运送须注意防止污染。

2． 取血：多采用静脉血，注意无菌操作，如需应用肝素等抗凝剂，也要注意消毒处理。血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液，可采用离心法分离，500～1000r／min，离心5～10min即可。

3． 动物组织：动物皮毛易隐藏微生物，且不易消毒，应特别注意无菌操作。
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五、细胞分散法

1． 机械分散　对于脑、胚胎、肿瘤等软组织，先用组织匀浆器研磨组织，再通过细胞筛获得单细胞悬液。

2． 胰蛋白酶消化　适合于消化间质较少的软组织，传代细胞消化也常采用，是应用较广泛的消化酶，由于Ca2+ 和Mg2+ 对胰蛋白酶活性有一定抑制作用，因此须用不含这些离子的缓冲液配制。将组织剪成1mm3大小，置于容器中，加入30～50倍体积的0.25%胰蛋白酶液，消化30～60min。

3．胶原酶消化　对胶原有较强的消化作用，适用消化纤维组织、上皮组织及瘤组织等。胶原酶的使用终浓度为200U/ml或0.1～0.3μg/ml，其消化作用缓和。一般将3～5倍胶原酶溶液加入已剪碎的组织块中，数小时或10余小时后，可见组织块逐步变小至几乎看不见，原来澄清的消化液转变成混悬液时，可以终止消化，如组织块较大、细胞量较多时，可于消化期间换消化液一次。消化液经低速离心5min后，去上清液，加入20％小牛血清培养液，轻轻打散细胞团，制成细胞悬液。

4． EDTA溶液分散　使用浓度为0.02%的EDTA溶液。常用于传代细胞的消化，作用温和，毒性小。
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六、淋巴细胞分离法

取肝素抗凝血1ml加Hanks液1ml稀释后，沿试管壁慢慢加入4ml淋巴细胞分离液之表面，勿与分离液混合。然后2000r/min水平离心20min，管内分4层，自上而下依次为血浆、单个核细胞(位于细胞分离液上界与血浆下界的中间呈白色雾状层)、颗粒白细胞(位于淋巴细胞分离液下界与底层红细胞上界的交界处)和红细胞(位于管底)。用毛细吸管沿管壁轻轻吸出的淋巴细胞层。然后用Hanks液洗两次，每次2000r/min离心10min，最后计数供用。

七、细胞计数

待测细胞悬液0.1ml加D-Hanks液0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml(死细胞着色),混合后滴入血球计数板内。于低倍镜下计数4角的4个大方格内的活细胞(透明未着色)总数,然后用下式计数:

细胞数/每毫升原液=(4大方格内活细胞数/4)×104×稀释倍数

细胞存活率=(活细胞数/活细胞数+死细胞数)×100％

在计数时遇到对大方格压线的细胞，应按数上不数下,数左不数右的原则进行计数。
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