主题：【分享】细菌内毒素检查法

供试品溶液的制备  某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的pH 值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH 值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH 值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
   

内毒素限值的确定  药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

                                      L=K / M

  式中  L 为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU /ml、EU / mg 或EU / U （活性单位）表示；

            K 为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU / ( kg · h ）表示，注射剂K = 5EU/(kg•h ) ，放射性药品注射剂K=2.5EU / （kg· h ) ，鞘内用注射剂K = 0.2EU / （kg· h ) ；

            M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml / ( kg · h ）、mg / ( kg · h ）或U / ( kg · h ）表示，人均体重按60kg 计算，人体表面积按1.62m² 计算。注射时间若不足1 小时，按1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027 即可转换为每千克体重剂量（M）。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

       

确定最大有效稀释倍数（MVD ）  最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数( 1→MVD )，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD :

MVD=cL / λ

式中  L 为供试品的细菌内毒素限值；

        c 为供试品溶液的浓度，当L 以EU / ml 表示时，则c等于1.0ml / ml ，当L 以EU / mg 或EU / U 表示时，c的单位需为mg / ml 或U / ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD 取1 ，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L ；

        λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度〔 EU / ml ) , 或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

方法1 凝胶法

      凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

      鲎试剂灵敏度复核试验  在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU / ml 表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

      根据赏试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡棍合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 秒钟。取分装有0.1ml 鲎试剂溶液的10mm×75mm 试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓶18 支，其中16 管分别加入0.1ml 不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4 管；另外2 管加人0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37 ℃ 士1 ℃ 的恒温器中，保温60 分钟±2 分钟。

      将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转l80° ，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

      当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效．按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λ_c）。

λ_c＝antilg （∑X / 4 )

式中  X 为反应终点浓度的对数值（lg ）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

      当λ_c在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

      干扰试验  按表1 制备溶液A 、B 、C 和D ，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数( MVD ）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表l 凝胶法干扰试验溶液的制备

编号	内毒素浓度/被加入内毒素的溶液	稀释用液	稀释倍数	所含内毒素的浓度	平行管数
A	无/供试品溶液	——	——	——	2
B	2λ/供试品溶液	供试品溶液	1	2λ	4
			2	1λ	4
			4	0.5λ	4
			8	0.25λ	4
C	2λ/检查用水	检查用水	1	2λ	4
			2	1λ	4
			4	0.5λ	4
			8	0.25λ	4
D	无/检查用水	——	——	——	2

注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。

只有当溶液A 和阴性对照溶液D 的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C 和B 的反应终点浓度的几何平均值（E_s和E_t ) :

E_s= antilg （∑X_s / 4 )

E_t=antilg （∑X_t : / 4 )

式中X_s X_t分别为系列溶液C 和溶液B 的反应终点浓度的对数值（lg）。

      当E_s在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及E_t在0.5E_s～ 2 E_s （包括0.5E_s和 2 E_s）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD 的进一步稀释，再重复干扰试验。

      可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。

      当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。

      当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

  检查法
    ( l )凝胶限度试验  按表2 制备溶液A 、B 、C 和D 。使用稀释倍数为MVD 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A 和B 。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表2 凝胶限度试验溶液的制备

编号	内毒素浓度／被加入内毒家的溶液	平行管数
A	无／供试品溶液	2
B	2λ／供试品溶液	2
C	2λ／检查用水	2
D	无／检查用水	2

注：A 为供试品溶液；B 为供试品阳性对照；C 为阳性对照；D 为阴性对照。

    结果判断  保温60 分钟±2 分钟后观察结果。若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，阳性对照溶液C 的平行管均为阳性，试验有效。
    若溶液A 的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A 的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A 的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A 需做4 支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。

（2）凝胶半定量试验  本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3 制备溶液A 、B 、C 和D 。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
      结果判断  若阴性对照溶液D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶液C 的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。

    系列溶液A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式c_E=antilg（∑X / 2 ）] 。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
    如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记为小于λ乘以供试品进行半定量试验的初始稀释倍数）。如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。

      若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不符合规定。

表3 凝胶半定量试验溶液的制备

编号	内毒素浓度/被加入内毒素的溶液	稀释用液	稀释倍数	所含内毒素的浓度	平行管数
A	无/供试品溶液	检查用水	1	——	2
			2	——	2
			4	——	2
			8	——	2
B	2λ/供试品溶液		1	2λ	2
C	2λ/检查用水	检查用水	1	2λ	2
			2	1λ	2
			4	0.5λ	2
			8	0.25λ	2
D	无/检查用水	——	——	——	2

注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。

      B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）。

      C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列。

      D为阴性对照。

方法2 光度测定法

      光度测定法分为浊度法和显色基质法。

      浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。

    显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或检测色度增长速度的方法。

      光度测定试验需在特定的仪器中进行，温度一般为37℃ ±1℃ 。

      供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

      为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

      标准曲线的可靠性试验  当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。

      用标准内毒素制成溶液，制成至少3 个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3 支平行管。同时要求做2 支阴性对照。当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。

      根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980 ，试验方为有效。否则须重新试验。

干扰试验  选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4 制备溶液A 、B 、C 和D 。

表4 光度测定法干扰试验溶液的制备

编号	内毒素浓度	被加入内毒素的溶液	平行管数
A	无	供试品溶液	至少2
B	标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）	供试品溶液	至少2
C	至少3 个浓度（最低一点设定为λ）	检查用水	每一浓度至少2
D	无	检查用水	至少2

注：A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液。

      B 为加人了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A 有相同稀释倍数的供试品溶液。

      C 为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

      D 为阴性对照。

    按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒紊含量c_t和c_s，再按下式计算该试验条件下的回收率（R ）。

R = (c_s-c_t ) ×100 %

    当内毒素的同收率在50 ％—200 ％之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

    当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验来验证处理的有效性。

      当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

      检查法  按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。

      使用系列溶液C 生成的标准曲线来计算溶液A 的每一个平行管的内毒素浓度。

      试验必须符合以下三个条件方为有效：

    ( 1 ）系列溶液C 的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；

    ( 2 ）用溶液B 中的内毒素浓度减去溶液A 中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50 % ～200 ％的范围内；

    ( 3 ）溶液D 的反应时间应大于标准曲线最低浓度的反应时间。

    结果判断  若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定．若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微孔板中的孔。

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》 的现行国家标准进行洁净度验证。

供试品检查时．如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。

除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培养温度为23～28 ℃ 。

检验结果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm² 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。

检验量

检验量即一次试验所用的供试品量（g 、ml 或cm²）。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100 cm²；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于阳性对照试验）。

检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4 片。

一般应随机抽取不少于检验用星（两个以上最小包装单位）的3 倍最供试品。

供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃ 。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。

除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。

1.液体供试品

取供试品10ml ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，混匀，作为l:10 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

2.固体、半固体或黏稠性供试品

取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1OOml ，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1:10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80 ，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

3.需用特殊方法制备供试液的供试品

（1）非水溶性供试品

方法1  取供试品5g（或5ml ) ，加至含溶化的（温度不超过45℃ ）5g司盘80 、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加人45 ℃ 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml ，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1 : 20 的供试液。

方法2 取供试品10g ，加至含20ml 无菌十四烷酸异丙酯（制法见附录XII A 无菌检查法中供试品的无菌检查项下）和无菌玻璃珠的适宜容器中．必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45 ℃ 的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10Oml ，振摇5～10 分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为l : 10 的供试液。

（2）膜剂供试品

取供试品100cm²，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml （必要时可增加稀释液），浸泡，振摇，作为1:10 的供试液。

（3）肠溶及结肠溶制剂供试品

取供试品10g ，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6 无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml ，置45 ℃ 水浴中，振摇，使溶解，作为1 :10 的供试液。

（4）气雾剂、喷雾剂供试品

取规定量供试品，置冰冻室冷冻约1 小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器吸出全部药液，加至适量的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（若含非水溶性成分，加适觉的无菌聚山梨酯80 ）中，混匀，取相当于10g或10ml 的供试品，再稀释成1:10 的供试液。

（5）贴剂供试品

取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂的粘贴面，以避免贴剂粘贴在一起。然后将其置于适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中，用力振荡至少30 分钟，制成供试液。贴剂也可采用其他适宜的方法制备成供试液。

（6）具抑菌活性的供试品

当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。

① 培养基稀释法  取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少，至不含抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级的供试液2ml ，每1ml供试液可等量分注多个平皿，倾注琼脂培养基，混匀，凝固，培养，计数。每1ml供试液所注的平皿中生长的菌落数之和即为1ml的菌落数，计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。

② 离心沉淀法  取一定量的供试液，500 转／分钟离心3 分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。

③ 薄膜过滤法  见细菌、霉菌及酵母菌计数项下的“薄膜过滤法”。

④ 中和法  凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释液或培养基中。