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主题：【分享】化学发光法研究三种参对DNA损伤的保护作用

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发表于：2011/06/08 13:32:32 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

DNA是生物体内一种重要的大分子,它的氧化损伤在癌症、衰老等疾病的发生过程中起着重要作用。^.OH 一直被认为是引起DNA损伤的重要因素。生命体内的^.OH可通过抽提核酸分子中碱基氢或戊糖氢，从而引起DNA碱基发生开环、脱落等变化，使DNA双螺旋间的氢键遭到破坏，DNA发生单链或双链断链、交联等作用^[1]。虽然活性自由基除^.OH外还有^.O₂^-，一般认为^.O₂^-对DNA等生物分子的损伤是由于它与H₂O₂作用形成中间产物·OH引起^[2]。因此，研究抑制^.OH对DNA损伤的药物有重要意义。
用于清除自由基的抗氧化剂种类很多,但是近年来,从天然物质中筛选高效、无毒的自由基清除剂成为生命医学的一个研究热点。参是非常好的抗氧化剂, 在参类中有人参和西洋参两大类。人参中又分红参和生晒参，二者区别在于加工方法不同：直接晒干名生晒参；蒸熟后晒干名红参。人参中抗衰老的生物活性物质虽然因作用而异，可主要是人参皂甙。但是,关于参对DNA的氧化损伤的保护作用的研究尚未见文献报道。
用化学发光法研究药物对DNA损伤的保护作用是一方便可靠的方法,已有不少报道。本实验利用CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂-DNA化学发光体系^[3]研究红参、生晒参、西洋参提取液对DNA受·OH损伤的抑制作用。实验证明，这些提取液都能有效地清除^.OH，抑制DNA受^.OH的损伤。并且实验发现对DNA损伤的保护作用效果分别为红参优于生晒参，生晒参好于西洋参。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
硫酸铜(分析纯,上海振兴试剂厂)；邻菲罗啉(Phen,分析纯,上海试剂三厂)；维生素C(V_C,分析纯,第二军医大学卫辉试剂厂)；过氧化氢(30%,分析纯,上海桃浦化工厂)。鱼精DNA(生化试剂,中国科学院上海生物化学研究所)；LKB-1250化学发光仪(1250Luminometer,样品池可恒温)。
1.2 参中有效成分的提取
红参、生晒参、西洋参的有效成分提取液的处理方法: 将市售红参、生晒参、西洋参在80°C烘箱中烘3h,分别称取1.4900g烘干的红参、生晒参、西洋参置于3个50mL的烧杯中,加入15mL的2次蒸馏水,在100°C水浴锅中加热2h,蒸发到5mL以下,再过滤提取液,在10.0mL容量瓶中定容。
1.3 测试方法
在10.0mL容量瓶中用0.1mol/L醋酸缓冲溶液(PH5.5)配制CuSO₄-Phen-Vc溶液，使Cu²⁺、Phen、Vc终浓度分别为3.0×10^-5mol/L、2.0×10^-4mol/L、2.0×10^-4mol/L，加入一定量的DNA和各种提取液，最后定容。取该溶液0.65mL放入发光仪样品池中，加入400m L3.0％的H₂O₂溶液，立即测量化学发光反应动力学曲线。

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2011/6/8 13:33:05 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2 结果与讨论
2.1 DNA浓度、H₂O₂浓度及测量温度、pH值对化学发光的影响
据文献^[3]报道,在CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂-DNA化学发光体系中生成^.OH，^.OH损伤DNA，产生一晚于Phen本身氧化发光信号的慢化学发光，其发光强度与DNA损伤程度有关，损伤越严重，发光强度越强。DNA受损伤的发光强度在一定范围内随DNA量的增加而增加^[4]。为得到最佳实验效果，本实验选用DNA终浓度为0.62m g/mL。
同时，CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂体系的发光强度随H₂O₂浓度的加大而增强，但当H₂O₂浓度过大时，发光强度趋于饱和，因此本实验选用H₂O₂终浓度为1.2mol/L。
测量温度对反应也有很大影响，温度越高，反应速度越快，发光峰出现越早，但峰高降低。这是由于温度升高使得反应生成的激发态发光物质发生无辐射跃迁的几率加大，很大一部分能量以热能形式散失到环境溶液中去，从而发光强度降低。本实验的测量温度选择为25± 0.5°C。
基底液的介质和酸度对体系的发光强度也有很大影响。溶液酸性越大，反应速度越慢，发光峰出现越晚，峰值越小；溶液越接近中性，反应速度越快，发光峰出现越早，峰值越大，但不易记录；溶液离子强度越大，发光峰越强。综合考虑,本体系用pH＝5.5的0.1 mol/L HAC-NaAC缓冲溶液最合适。
2.2 3种参提取液对DNA保护作用的比较


	图1 3种参提取液对DNA损伤发光的保护作用 a CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂; b a+DNA; c b+红参提取液; d b+生晒参提取液; e b+西洋参提取液		图2 3种参提取液对基底液损伤发光的保护作用 a CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂; b a+红参提取液; c a+生晒参提取液; d a+西洋参提取液

如图1所示，在DNA存在下，产生一明显延迟于基底反应峰的发光峰，且发光峰强度显著增加。由于^.OH对DNA的损伤严重，DNA的损伤发光较强。因此，DNA的损伤发光峰几乎掩盖了Phen的发光峰(见图1的a、b)。
当在体系中分别加入三种不同的人参提取液后，使DNA损伤引起的发光峰的强度明显减小(见图1c、d、e)，且发光时间延长，表明对DNA损伤有明显的抑制作用。另一方面,当在基底液(CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂)体系中加入3种参提取液,由图2 b、c、d显示,3种参提取液也能够抑制Phen的发光。由此证明，提取液对CuSO₄-Phen-Vc-H₂O₂-DNA发光体系从两个方面起作用，一方面清除^.OH自由基，保护DNA免受损伤，从而抑制DNA发光物的生成；另一方面抑制Phen发光物的生成。因此，对在相同的参提取液存在下的DNA发光曲线(图1 c、d、e)分别进行积分，求得1000s内的发光积分值，减去在基底反应液中同样的参提取液存在下的发光曲线(图2 b、c、d)同时间内的发光积分值，即为参提取液存在下的DNA损伤发光值。表1列出了红参、生晒参、西洋参提取液存在下的DNA损伤发光值, 从表中可知，红参存在下DNA损伤发光值最小，生晒参次之，西洋参最大。换而言之,由所得数据说明，对DNA损伤起保护作用的效果分别为红参优于生晒参，生晒参优于西洋参。

表1 红参、生晒参、西洋参提取液存在下的DNA损伤发光值

不同的参提取液	红参	生晒参	西洋参
DNA损伤发光/mV^.s	716. 7	1557. 1	2210. 6

积分时间：1000s

3 结论
通过实验证明参提取液对DNA氧化损伤所引起的化学发光有明显的抑制作用。而其抑制作用为红参优于生晒参，生晒参优于西洋参。这是因为在参中起到抗氧化作用的活性物质虽然不只一种，但主要是人参皂甙，而人参皂甙的甙元主要分为原人参二醇和原人参三醇 , 人参三醇型皂甙比人参二醇型皂甙生理活性强。据文献^[5]报道人参(红参和生晒参)中所含三醇皂甙的量比西洋参所含三醇皂甙的量高得多。另一方面,对于红参，在加工过程中皂甙成分之间发生转化，产生诸如maltol等新的抗氧化剂和水杨醛等生理活性更强的化合物^[6-8]。因此，抗氧化能力分别是红参优于生晒参，生晒参优于西洋参。