主题：【资料】手性药物拆分的几种方法及研究进展

手性是自然界的一种普遍现象，构成生物体的基本物质如氨基酸、糖类等都是手性分子。手性异构体(对映体)在药物中占有很大的比例，据统计，已知药物中约有30%~40%是手性的［1］。经由化学合成得到的药物往往是对映体，不是单一的光学异构体。虽然其物理化学性质基本相同，但是由于药物分子所作用的受体或靶位是氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分子等，它们对与其结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求，因此，对映体药物在体内往往呈现很大的药效学、药动学等方面的差异(图1)。鉴于此，美国食品医药管理局(FAD)规定，今后研制具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果［2］，欧共体也采取了相应措施，因此手性拆分已成为药理学研究和制药工业日益迫切的课题。

　　利用化学拆分法、超临界流体色谱法、膜法、酶法以及模拟流动床法分离药物对映体，已成为新药研究和分析化学的领域之一。本文综述了近几年来利用上述方法拆分手性异构体研究的新进展。

　　1  化学法

　　化学拆分法是广泛使用的一种方法，经典的化学拆分是利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体，再利用其物理性质的差异将其拆分。但此类方法存在收率较低、拆分剂消耗大及在拆分的化合物类型上受到限制等缺点。近几年来，随着主客体化学的深入研究而发展起来的包结拆分(inclusion resolution)由于其拆分效率高、操作简单及适用条件广泛等优点而受到重视。

　　包结拆分的基本原理是：手性主体化合物通过氢键及分子间的次级作用，选择地与客体分子中一个对映体形成稳定的包结络合物析出来，从而实现对映体的分离，如图2所示［3］。
　　
　　由于包结拆分中主体分子与客体分子间不发生任何化学反应，只是通过分子间作用力来实现拆分，因而很容易地通过如柱、溶剂交换以及逐级蒸馏等手段与客体分离和可循环使用［4］。甾类化合物是最优良的包结主体之一，因为其化学结构中富含多种功能基且刚性很强，其中胆汁酸类衍生物(图3)广泛地应用于手性醇、酮及手性亚砜类化合物的拆分。

　　Hisakazu［4］等利用一种酒石酸衍生物［(R,R)(-)trans4,5bis(hydroxydiphenylmethyl)1,4dioxaspiro］［4.4］nonane］(图4)作为包结主体拆分了外消旋的甲基取代环丙烯等一系列化合物，经蒸馏后，得到光学纯度为28%~75%的包结络合物。

　　2  超临界流体色谱法(SFC)

　　超临界流体色谱具有简单、高效、易于变换操作条件等优点，已成为和高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)互为补充的拆分方法，因其具有独特的优越性，应用前景极为广阔。Petersson对1993年以前SFC在手性化合物分离上的应用作了综述［5］，李桦等总结了SFC在手性药物拆分中的优越性［6］。

　　根据手性选择剂种类不同，SFC分离方式主要包括［7］氨基酸和酰胺类手性固定相、Prikle型手性固定相、环糊精型键合固定相、多糖型的手性固定相以及其他手性固定相如聚甲基异丁烯酯等。但是SFC正处于迅速发展阶段，各种参数(如温度、压力、流动相的组成和密度等)对分离度的影响机制还未完全清楚。人们可借鉴HPLC、GC、HPCE手性分离的经验和成果，研制出各种类型的适合SFC分析的手性固定相及操作条件。

　　最近，Nozal［7］等用Chiralpak AD柱和Chiralcel OD柱在SFC条件下拆分了驱肠蠕虫药阿苯哒唑亚砜化合物(图5)，并研究了甲醇、乙醇、2丙醇及乙腈等有机溶剂对立体选择型的影响。结果表明，在以Chiralpak AD柱为固定相时，用2丙醇可以获得最好的拆分效果；而在Chiralcel OD柱上用甲醇效果最好。

　　3  膜分离法

　　氨基酸的生物转移通常是由埋在生物膜中的载体蛋白来传递的，这种转移的对映体选择性是非常高的。很久以来，人们就希望将这种对映体转移体系用于分离技术中，通过膜分离进行旋光异构体的拆分正是这种生物过程的模拟。

　　3.1  液膜分离法

　　1979年D.J.cram等首先报道了一种膜分析方法。在这种液膜体系中，手性分子(主体)与外消旋(客体)结合，通过氯仿载其从一水溶液至另一水溶液再释放出来。这种装置能够同时连续地将外消旋体拆分为两个对映体，得到旋光纯度为70%~90%。另外，一种氨基酸光学拆分液体膜在光学活性冠醚中浸入聚合薄膜的形式而得以制备［8］。手性冠醚(图6A)通过液体膜可作为氨基酸及胺类对映体选择性的中间媒介，几乎所有的氨基酸都可通过它们的对映体形式分离，其中大空间位阻基团的氨基酸会有较高的光学拆分率。

　　3.2  手性固定膜

　　近年来，对映体膜分离的另一个新发展是手性固体膜的发展［9］。Maruryama等认为，物质通过膜的渗透是由被拆分物质早膜中的分配行为和他们在膜中的扩散速度来决定的。为了提高膜的对映体选择性，需要优化这两个因素。据此他们制备了有两亲性侧链的α螺旋链聚氨基酸衍生物，作为手性膜材料，成功拆分了酪氨酸和色氨酸，D，L对映体的渗透比率大于8.0，经过500 h的渗透，选择性没有下降。纤维素衍生物固体膜在手性拆分中的应用也较多。尤其是纤维素三(3.5二甲基苯基氨甲酸酯，CTPC)(图6B)膜表现出极好的手性选择性。
Jang［10］等最近用海藻酸钠(SA，图6C)和脱乙酰壳多糖(CS，图6D)分别与戊二醛所生成的交联复合物作为膜材料，对外消旋的色氨酸进行了拆分，光学纯度达98%以上。

　　4  模拟流动床色谱(SMB)法

　　模拟流动床色谱(simulated moving bed chromatography)技术是由D.B.Broughton在1961年的一个专利中提出来的。最初这种技术用于正己烷和环己烷的分离，后来又用于间二甲苯和对二甲苯的大规模制备。模拟流动床手性拆分系统在运行过程中，旋转阀间歇性地开关，控制在不同时间外消旋体的进样、新溶剂的注入和两个旋光异构体的提取位置。SMB的流程简图如图7所示［11］。

　　装置是由12根色谱柱串联，由一循环泵将最后一根柱子中的溶液泵回到第一根形成环路。将外消旋混合物在两根柱子之间加入，经一段时间后，保留时间小的组分在前面，保留时间长的组分在后面，在预定的时间和位置，分别将其取出小部分。因为流动相的运动和固定相是相对反向的，因此这种逆流色谱性质使得传质驱动力达到最大，这样就减小了洗脱剂的消耗量。

　　Nagamatsu［12］等用中等规模的SMB成功的拆分了奎尼丁甲羟戊酸酯(DOLE，图8)，所采用的是分析型Chiralcel OF柱，流动相为ψ(正己烷∶2丙醇)=8∶2，流速为1.0 mL/min。试验还通过计算机软件寻求最佳的操作条件，结果表明，较高的流速和较短的间歇时间可以提高对映体的拆分，其无论是从产率和溶剂消耗量上都优于液相色谱法。

　　5  酶法

　　应用酶和微生物在底物上引进手性中心的方法有很久的历史了，如氢化可的松及维生素C的生产等。因为酶的活性中心是一个不对称环境，有利于识别消旋体，在一定条件下，酶只能催化消旋体中的一个对映体发生反应而成为不同的化合物，从而使两个对映体分开，反应产物的对映过剩百分率可达100%。另外，酶催化的反应大多在温和的条件下进行，温度通常不超过0~50 ℃，pH值接近中性；而且酶无毒，易降解不会造成环境污染，适于大规模生产。因此，用催化效率高、专一性强的酶拆分消旋体是获取对映体纯化合物的捷径。随着酶固定化技术、多相反应器等新技术日趋成熟，大大促进了酶拆分技术的发展，脂肪酶、酯酶、蛋白酶、转氨酶等诸多酶类已用于外消旋体的拆分［13］。

　　脂肪酶(Lipase)是研究最早的一类酶，是一类特殊的酯键水解酶。脂肪酶具有高度的选择性和立体专一性，且反应条件温和，副反应少，适用于催化非水相介质中的化学反应。Michimasa［14］等分别用Pseudomonas sp脂肪酶和猪胰脂肪酶(PPL)对2苯1丙醇进行了拆分，反应是通过两种酶分别催化酯交换反应而进行，使得对映体拆分率分别提高到了39%和41%。

　　另外，酯酶具有很高的工业价值，其应用前景也极为广阔。最近，Jianxin［15］等利用Pseudomaonas cepacia脂肪酶拆分了一类酰基取代的1环己烯衍生物。因为在抗体或抗肿瘤的天然活性物质中常含有此基团，是一类极有药用前途的母核。该方法通过酶催化酯交换反应，而得到了产率较高的光学纯化合物，且提供了反应过程监测方法，因此可有效的推广到该类化合物的一系列衍生物的合成与拆分，其主要反应如图9所示。图9  1-环己烯衍生物的拆分
Fig.9  The resolution of derivates of 1-hexene
 
　　随着科技的进步，酶法在实现手性药物的拆分和生物转化方面发挥着越来越大的作用，各种新的方法与技术正层出不穷，抗体酶、交联酶晶体、固定化酶及非水相酶学等都成为当今酶学研究的活跃领域，这些技术的发展与完善必将推进拆分技术的发展。

　　6  小结

　　目前在药物对映体拆分中，采用的主要手段是气相色谱法和高效液相色谱法［18］，但因其手性柱费用高，易污染且手性衍生化常带进副产物等缺点仍需进一步研究。而SFC正处于发展阶段，虽各种参数的影响尚未完全清楚，但随其理论和技术的日臻完善，SFC在手性物质分析的应用上将得到进一步发展。模拟流动床法克服了一般手性液相色谱的不足，但设备投资较大；膜分离法和酶法在生产方面有较明显的优势，操作简便且不易污染。随着对各种对映体拆分机制更为深入的研究，手性拆分技术必将更加完善。

手性是自然界的一种普遍现象，构成生物体的基本物质如氨基酸、糖类等都是手性分子。手性异构体(对映体)在药物中占有很大的比例，据统计，已知药物中约有30%~40%是手性的［1］。经由化学合成得到的药物往往是对映体，不是单一的光学异构体。虽然其物理化学性质基本相同，但是由于药物分子所作用的受体或靶位是氨基酸、核苷、膜等组成的手性蛋白质和核酸大分子等，它们对与其结合的药物分子的空间立体构型有一定的要求，因此，对映体药物在体内往往呈现很大的药效学、药动学等方面的差异(图1)。鉴于此，美国食品医药管理局(FAD)规定，今后研制具有不对称中心的药物，必须给出手性拆分结果［2］，欧共体也采取了相应措施，因此手性拆分已成为药理学研究和制药工业日益迫切的课题。

　　利用化学拆分法、超临界流体色谱法、膜法、酶法以及模拟流动床法分离药物对映体，已成为新药研究和分析化学的领域之一。本文综述了近几年来利用上述方法拆分手性异构体研究的新进展。

　　1  化学法

　　化学拆分法是广泛使用的一种方法，经典的化学拆分是利用手性试剂与外消旋体反应，生成两个非对映异构体，再利用其物理性质的差异将其拆分。但此类方法存在收率较低、拆分剂消耗大及在拆分的化合物类型上受到限制等缺点。近几年来，随着主客体化学的深入研究而发展起来的包结拆分(inclusion resolution)由于其拆分效率高、操作简单及适用条件广泛等优点而受到重视。

　　包结拆分的基本原理是：手性主体化合物通过氢键及分子间的次级作用，选择地与客体分子中一个对映体形成稳定的包结络合物析出来，从而实现对映体的分离，如图2所示［3］。
　　
　　由于包结拆分中主体分子与客体分子间不发生任何化学反应，只是通过分子间作用力来实现拆分，因而很容易地通过如柱、溶剂交换以及逐级蒸馏等手段与客体分离和可循环使用［4］。甾类化合物是最优良的包结主体之一，因为其化学结构中富含多种功能基且刚性很强，其中胆汁酸类衍生物(图3)广泛地应用于手性醇、酮及手性亚砜类化合物的拆分。

　　Hisakazu［4］等利用一种酒石酸衍生物［(R,R)(-)trans4,5bis(hydroxydiphenylmethyl)1,4dioxaspiro］［4.4］nonane］(图4)作为包结主体拆分了外消旋的甲基取代环丙烯等一系列化合物，经蒸馏后，得到光学纯度为28%~75%的包结络合物。

　　2  超临界流体色谱法(SFC)

　　超临界流体色谱具有简单、高效、易于变换操作条件等优点，已成为和高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)互为补充的拆分方法，因其具有独特的优越性，应用前景极为广阔。Petersson对1993年以前SFC在手性化合物分离上的应用作了综述［5］，李桦等总结了SFC在手性药物拆分中的优越性［6］。

　　根据手性选择剂种类不同，SFC分离方式主要包括［7］氨基酸和酰胺类手性固定相、Prikle型手性固定相、环糊精型键合固定相、多糖型的手性固定相以及其他手性固定相如聚甲基异丁烯酯等。但是SFC正处于迅速发展阶段，各种参数(如温度、压力、流动相的组成和密度等)对分离度的影响机制还未完全清楚。人们可借鉴HPLC、GC、HPCE手性分离的经验和成果，研制出各种类型的适合SFC分析的手性固定相及操作条件。

　　最近，Nozal［7］等用Chiralpak AD柱和Chiralcel OD柱在SFC条件下拆分了驱肠蠕虫药阿苯哒唑亚砜化合物(图5)，并研究了甲醇、乙醇、2丙醇及乙腈等有机溶剂对立体选择型的影响。结果表明，在以Chiralpak AD柱为固定相时，用2丙醇可以获得最好的拆分效果；而在Chiralcel OD柱上用甲醇效果最好。

　　3  膜分离法

　　氨基酸的生物转移通常是由埋在生物膜中的载体蛋白来传递的，这种转移的对映体选择性是非常高的。很久以来，人们就希望将这种对映体转移体系用于分离技术中，通过膜分离进行旋光异构体的拆分正是这种生物过程的模拟。

　　3.1  液膜分离法

　　1979年D.J.cram等首先报道了一种膜分析方法。在这种液膜体系中，手性分子(主体)与外消旋(客体)结合，通过氯仿载其从一水溶液至另一水溶液再释放出来。这种装置能够同时连续地将外消旋体拆分为两个对映体，得到旋光纯度为70%~90%。另外，一种氨基酸光学拆分液体膜在光学活性冠醚中浸入聚合薄膜的形式而得以制备［8］。手性冠醚(图6A)通过液体膜可作为氨基酸及胺类对映体选择性的中间媒介，几乎所有的氨基酸都可通过它们的对映体形式分离，其中大空间位阻基团的氨基酸会有较高的光学拆分率。

　　3.2  手性固定膜

　　近年来，对映体膜分离的另一个新发展是手性固体膜的发展［9］。Maruryama等认为，物质通过膜的渗透是由被拆分物质早膜中的分配行为和他们在膜中的扩散速度来决定的。为了提高膜的对映体选择性，需要优化这两个因素。据此他们制备了有两亲性侧链的α螺旋链聚氨基酸衍生物，作为手性膜材料，成功拆分了酪氨酸和色氨酸，D，L对映体的渗透比率大于8.0，经过500 h的渗透，选择性没有下降。纤维素衍生物固体膜在手性拆分中的应用也较多。尤其是纤维素三(3.5二甲基苯基氨甲酸酯，CTPC)(图6B)膜表现出极好的手性选择性。
Jang［10］等最近用海藻酸钠(SA，图6C)和脱乙酰壳多糖(CS，图6D)分别与戊二醛所生成的交联复合物作为膜材料，对外消旋的色氨酸进行了拆分，光学纯度达98%以上。

　　4  模拟流动床色谱(SMB)法

　　模拟流动床色谱(simulated moving bed chromatography)技术是由D.B.Broughton在1961年的一个专利中提出来的。最初这种技术用于正己烷和环己烷的分离，后来又用于间二甲苯和对二甲苯的大规模制备。模拟流动床手性拆分系统在运行过程中，旋转阀间歇性地开关，控制在不同时间外消旋体的进样、新溶剂的注入和两个旋光异构体的提取位置。SMB的流程简图如图7所示［11］。

　　装置是由12根色谱柱串联，由一循环泵将最后一根柱子中的溶液泵回到第一根形成环路。将外消旋混合物在两根柱子之间加入，经一段时间后，保留时间小的组分在前面，保留时间长的组分在后面，在预定的时间和位置，分别将其取出小部分。因为流动相的运动和固定相是相对反向的，因此这种逆流色谱性质使得传质驱动力达到最大，这样就减小了洗脱剂的消耗量。

　　Nagamatsu［12］等用中等规模的SMB成功的拆分了奎尼丁甲羟戊酸酯(DOLE，图8)，所采用的是分析型Chiralcel OF柱，流动相为ψ(正己烷∶2丙醇)=8∶2，流速为1.0 mL/min。试验还通过计算机软件寻求最佳的操作条件，结果表明，较高的流速和较短的间歇时间可以提高对映体的拆分，其无论是从产率和溶剂消耗量上都优于液相色谱法。

　　5  酶法

　　应用酶和微生物在底物上引进手性中心的方法有很久的历史了，如氢化可的松及维生素C的生产等。因为酶的活性中心是一个不对称环境，有利于识别消旋体，在一定条件下，酶只能催化消旋体中的一个对映体发生反应而成为不同的化合物，从而使两个对映体分开，反应产物的对映过剩百分率可达100%。另外，酶催化的反应大多在温和的条件下进行，温度通常不超过0~50 ℃，pH值接近中性；而且酶无毒，易降解不会造成环境污染，适于大规模生产。因此，用催化效率高、专一性强的酶拆分消旋体是获取对映体纯化合物的捷径。随着酶固定化技术、多相反应器等新技术日趋成熟，大大促进了酶拆分技术的发展，脂肪酶、酯酶、蛋白酶、转氨酶等诸多酶类已用于外消旋体的拆分［13］。

　　脂肪酶(Lipase)是研究最早的一类酶，是一类特殊的酯键水解酶。脂肪酶具有高度的选择性和立体专一性，且反应条件温和，副反应少，适用于催化非水相介质中的化学反应。Michimasa［14］等分别用Pseudomonas sp脂肪酶和猪胰脂肪酶(PPL)对2苯1丙醇进行了拆分，反应是通过两种酶分别催化酯交换反应而进行，使得对映体拆分率分别提高到了39%和41%。

　　另外，酯酶具有很高的工业价值，其应用前景也极为广阔。最近，Jianxin［15］等利用Pseudomaonas cepacia脂肪酶拆分了一类酰基取代的1环己烯衍生物。因为在抗体或抗肿瘤的天然活性物质中常含有此基团，是一类极有药用前途的母核。该方法通过酶催化酯交换反应，而得到了产率较高的光学纯化合物，且提供了反应过程监测方法，因此可有效的推广到该类化合物的一系列衍生物的合成与拆分，其主要反应如图9所示。图9  1-环己烯衍生物的拆分
Fig.9  The resolution of derivates of 1-hexene
 
　　随着科技的进步，酶法在实现手性药物的拆分和生物转化方面发挥着越来越大的作用，各种新的方法与技术正层出不穷，抗体酶、交联酶晶体、固定化酶及非水相酶学等都成为当今酶学研究的活跃领域，这些技术的发展与完善必将推进拆分技术的发展。

　　6  小结

　　目前在药物对映体拆分中，采用的主要手段是气相色谱法和高效液相色谱法［18］，但因其手性柱费用高，易污染且手性衍生化常带进副产物等缺点仍需进一步研究。而SFC正处于发展阶段，虽各种参数的影响尚未完全清楚，但随其理论和技术的日臻完善，SFC在手性物质分析的应用上将得到进一步发展。模拟流动床法克服了一般手性液相色谱的不足，但设备投资较大；膜分离法和酶法在生产方面有较明显的优势，操作简便且不易污染。随着对各种对映体拆分机制更为深入的研究，手性拆分技术必将更加完善。