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主题：【第六届原创】UPLC-MSMS检测水中的微囊藻毒素LR

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阳光海岸
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发表于：2011/11/17 15:47:54 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
维权声明：本文为lizhixuan原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。
1              引言

1.1    概述

        微囊藻毒素(Microcystin)是一种篮绿藻毒素，由蓝绿藻水华所引起。由于它能产生环状七肽肝毒素，可致家畜死亡和人类肝中毒。WHO规定它在水环境中的指标值为1ug/L，中国在2002年发布的《地表水环境质量标准》(GB3838-2002)中的特定项目标准限值亦规定为1ug/L Microcystin-LR。Microcystin-LR是微囊藻毒素中的一种。由于它分子量大、极性强，非常适合LC/MS检测。

1.2    测定方法

        水样冻融1-3次，破碎藻细胞，解冻后用0.2um滤膜(或双层0.45um滤膜)过滤，进样5.00mL用On-line SPE-UPLC-MSMS测定Microcystin-LR总量。以C18 UPLC专用色谱柱，0.5%甲酸/1%甲醇溶液和0.5%甲酸/90:10乙腈甲醇为流动相，用在线固相萃取-超高校液相色谱-质谱检测器(On-line SPE-UPLC-MSMS)测定microcystin-LR的色谱峰。用外标法计算含量。

       

1.3    干扰

        在水样中凡能被固相萃取柱萃取的化合物都有可能造成干扰。水样在储存和萃取过程中，蓝藻的细胞破裂可释放毒素，会造成水中溶解的毒素含量增高。另外，要防止高浓度到低浓度的交叉污染。

       

1.4    水样的储存

        微囊藻毒素在常温下容易生物降解，在有余氯时容易被氧化降解，所以水样采集后应尽快萃取，有余氯的水样需要用硫代硫酸衲脱氯。水样采集在1L的棕色玻璃瓶中。若水样采集后确实不能马上处理，则把水样用玻璃滤纸过滤，处理水加80mg的脱氯剂，储存于4oC的冰箱中。

       

1.5    测定范围

        原水和处理水中可溶解的和总的微囊藻毒素Microcystin-LR。

2        仪器
2.1        Waters ACQUITY UPLC  H-Class QSM
2.2    Waters ACQUITY UPLC  H-Class BSM
2.3        Waters ACQUITY  UPLC  TQ Detector (ESI)
2.4    2777高压样品管理器 含Waters Online SPE system
2.5    Waters ACQUITY  UPLC 色谱注加热器/冷却器
2.6        Waters ACQUITY BEH C18 1.7um，2.1×50mm色谱柱
On-line Extraction Column Oasis HLB 20um ，2.1×30mm Column
2.7        样品过滤装置，GF/C glass filter， 0.2um GV(Millipore)萃取液过滤膜
2.8        注射针：250uL，5.00mL。小体积容量瓶，23.0ml。
3        试剂
3.1        微囊藻毒素固体标准或微囊藻毒素溶液标准(10.0mg/L，购于SIGMA公司)
        Microcystin-LR固体标准0.500mg(C49H74N10O12, MW=995.2)购于SIGMA公司。

3.2        微囊藻毒素储存标准（10.0mg/L）
        用甲醇溶解0.500mg Microcystin-LR于50ml容量瓶中。

3.3        微囊藻毒素标准系列
a)        1000ug/L Microcystin-LR和50.0ug/L Microcystin-LR中间液。
        用250uL 注射针取200ul 浓度为10mg/L Microcystin-LR，用甲醇定容至2.00ml容量瓶中为1000ug/L Microcystin-LR。用250uL 注射针取100ul 浓度为1000ug/L Microcystin-LR，用甲醇定容至2.00ml容量瓶中为50.0ug/L Microcystin-LR。
b)        0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500  ug/L Microcystin-LR标准系列：        用注射针分别取25、50.0、100、150、200、250uL浓度为100ug/L Microcystin-LR标准溶液，用纯水定容至25.0mL容量瓶中。

3.4        甲醇和乙腈为HPLC级，MERKER公司。

3.5        配制的溶液：    BSM-A1用甲醇， BSM-B2用乙腈
3.5.1  0.5%甲酸/1%甲醇水溶液：用移液管吸5mL甲酸(MERKER公司)和10mL甲醇至980-990mL纯水中。BSM-A2 and QSM-B用
3.5.2  0.5%甲酸/90:10乙腈甲醇溶液：用移液管吸5mL甲酸(MERKER公司) 于900mL乙腈，加入100mL甲醇混匀。BSM-B1 and QSM-C用
3.5.3  2%氨水/1%甲醇水溶液：用量筒取71mL氨水(MERKER公司)和10mL甲醇至920ml纯水中。QSM-A用
3.5.4  50:50/甲醇丙酮溶液：用量筒分别取500mL甲醇和丙酮混匀。QSM-D用
3.5.5  10%甲醇水溶液：用量筒取50mL甲醇至500ml纯水中。弱洗针液用
3.5.6  50%甲醇水溶液：用量筒取250mL甲醇至500ml纯水中。强洗针液用
3.5.7  10%甲醇水溶液：用量筒取100mL甲醇至1000ml纯水中。Prime sealwash用，5%甲醇亦可。

3.6        N2，99.9%

4        操作步骤
4.1        色谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY BEH C18 1.7um，2.1×50mm
SPE柱：On-line Extraction Column Oasis HLB，20um 2.1×30mm
流动相：0.5%甲酸/1%甲醇水溶液 /  0.5%甲酸/90:10乙腈甲醇溶液
流速：0.2mL/min
柱温：35oC
注射体积：5.00mL

4.1.1梯度洗脱程序：SPE_System Mic-LR2011        略
4.2        质谱条件： SPE_MS_20110531 Mic-LR
        Source (ESI+)
        电离方式：ESI(positive)
        电离电压(Capillary)：2.9kV
        锥孔电压(Cone)：75V (Microcystin-RR:40V,  Microcystin-YR (下次定)and  Microcystin-LR:75V)
        Extractor：3V
RF Lens：0.3V
离子源温度(Source Temp)：110oC
去溶剂温度(Cone Temp)：400oC
去溶剂气流量(Desolvation Gas Flow)：300L/Hr
锥孔气流量(Cone Gas Flow)：40L/Hr
LM Resolution：15
HM Resolution：15
Ion Energy：0.4
MS 模式：MSMS
Entrance：0
Collision：70
Exit：0
LM Resolution：15
HM Resolution：15
Ion Energy： 0.5
Gain：1.00
Collision Gas：0.2mL/min

Edit MS Method
Type：MRM of 2 mass paris ，单离子995.7>135.2定量，
双离子995.7>135.2、995.7>107.1定性。
Ion Mode：ES+
Span(Da)：0.1
Inter-Channel Delay：-1.000
Interscan Delay：-1.000
Span：0.1
Start Time(Min)  0.0
End Time(Min)  11.0
Use Tune Cone Voltage
Use Tune Collsion Energy

4.3        标准曲线的制作（外标法）
        标准曲线在7.18分钟左右出峰，标准样品的色谱图和质谱图见图1和图2。分别进样5.0mL浓度为0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 ug/L的标准系列，以浓度和峰面积制作标准曲线。

4.4        样品分析
4.4.1        水样的处理
        用125mL聚乙烯瓶取水样100 mL水样。
水源水放入-30℃冰箱冻8小时以上，然后水流中解冻至实温。这样的冻融过程持续1-3次即可。用GF/C玻璃滤膜加0.2um滤膜(或双层0.45um滤膜)过滤。若是处理水，加20mg硫代硫酸钠脱氯，最好过滤。过滤后的水样储存于23m L样品瓶中。
        （源水水样不冻融检测得到的结果是溶解性的Microcystin-LR。）
 
4.4.2  萃取样的分析
        用与标准样品相同的色谱条件对萃取样进行LC-MS分析。

5        计算
        根据标准曲线和水样的峰面积计算水样的浓度

6        检出限
a)        仪器的定量检出下限大约为0.01ug/L，见图3，图中的信噪比为50(0.005ug/L)。
b)        若以0.01ug/L测试，测定的回收率介于109%-132% 之间。0.005/L测定的回收率介于106%-176% 之间,超出了50%-150% 的要求，所以定量检出下限定为0.01ug/L。
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阳光海岸
lizhixuan
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2011/11/18 8:34:18 Last edit by capinter
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2011/11/17 15:49:42 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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2011/11/18 8:34:37 Last edit by capinter
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2011/11/17 15:50:26 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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2011/11/18 8:34:53 Last edit by capinter
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2011/11/17 15:51:43 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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2011/11/18 8:35:09 Last edit by capinter
阳光海岸
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2011/11/17 15:53:11 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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2011/11/18 8:35:24 Last edit by capinter
happy爱米粒
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2011/11/17 18:11:21 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
怎么是繁体啊，楼主改成中文简体，再上点图片，加点数据就可以参加原创了
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Longer
ptwx
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2011/11/17 18:56:42 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
挺好的应用和实验条件，做得挺细致全面。
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阳光海岸
lizhixuan
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2011/11/18 10:24:04 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回复6楼，我已经改为简体字了。我的电脑是公司电脑，发文件和图片不被允许，所以没有色谱图等！望见谅！
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小猪飞飞
zpf20031212
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2011/11/18 15:01:09 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我可以做到0.001ug/L，当然前处理需要富集一下，取样量要比楼主大些。想问下，楼主说在常温下容易降解，在余氯的情况下容易氧化。请问降解、氧化后的产物一样吗？毒性增强了还是减弱了？有没有做过这方面的研究。
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阳光海岸
lizhixuan
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2011/11/18 15:38:44 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回复小猪飞飞：
我的检测是在线固相萃取Online SPE，进样体积5mL，检出限本来可以做更低，如果按色谱要求信噪比3定义检出限，我的检出限可以达到0.0003ug/L。如果定义定量下限信噪比为20我的定量下限可以是0.002ug/L。
但是为了使自己的定量浓度可靠，我按照美国的定量下限浓度的回收率达到50-150%来定义的，所以做的定量下限浓度比较高为0.01ug/L。
Mic-LR常温会分解，和Cl2会氧化它，产物本人未做研究。但是用Elisa可以确认的是毒性降低了很多很多！
望各位朋友见谅！
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2011/11/18 15:43:12 Last edit by lizhixuan
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