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主题：【原创】Ultimate XB-C18柱高效液相色谱法测试油类样品中胆固醇含量的有关介绍

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毛毛儿
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发表于：2011/11/18 17:20:20 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
该帖子已被samanthalas设置为精华；
续

  之前地沟油的消息风靡一时，其实地沟油早不是一天两天的事情，基本上是隔几年就会翻出来炒作一番，前期网上有公布一项关于鉴别地沟油中四种特征性物质的介绍，其中提到了胆固醇一项，曾经是这么说的：

核心揭秘：4类指标让地沟油现出原形

　　第一项指标：多环芳烃(PAHs)。多环芳烃是食用油加热如炒、烤、炸、煎等后产生的含多个苯环的芳香族化合物，属于持久性有机污染物，绝大多数PAHs已被国际癌症研究中心列为致癌物。

　　第二项指标：胆固醇。食用植物油中一般不含胆固醇或含量极低。技术人员根据地沟油中可能含有动物源性成分，推断如果检出胆固醇并超过一定范围，可怀疑该油脂为地沟油。

　　第三项指标：电导率。正常油脂几乎是不导电的，但油脂酸败后产生的各种极性物质可使油脂产生导电性。地沟油由于掺杂了大量金属离子而产生导电性，电导率较高。

　　第四项指标：特定基因组成。地沟油是多种不同来源的废弃油脂混合而成，往往含有动物油脂，检测人员根据分子生物学基因鉴定方法，鉴定油脂中的动物基因，来判定食用油中是否含有动物源性成分。（此内容引自仪器信息网资讯中心）

当时这则消息在很多大小网站都能找到，于是在领导的指示下，我们实验室也积极开展此项工作，因多环芳烃之前已经有做过，而电导率和特定基因组成与公司的产品没有直接的关系，所以我们选取了第二项：胆固醇着手实验。而当我们的实验进行到大约一半的时候，又有一则官方消息公布，消息大概内容是这样的：2011年10月13日， 距离9月中旬公安部公布破获跨省地沟油大案已有一个月的时间，卫生部新闻发言人邓海华昨日透露，目前征集到的5种地沟油检测方法特异性不强，有关部门将再向社会公开征集方法。 资料显示，从各国情况看，目前，地沟油并无特效的检测技术（此内容引自仪器信息网资讯中心）。

当时看到这个消息的时候，我想我这个项目还要不要继续了，总不能半途而废吧，于是把原本的题目“通过检测胆固醇鉴别地沟油”改为了“用液相色谱法测试油类样品中胆固醇的含量”。其实做到后面，我也考虑到一个很严肃的问题，我到底去哪找有代表意义的地沟油样品呢，如果没有这样的代表样品做验证，那也是文不对题…….

言归正传，发正文实验部分。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

LC310高效液相色谱仪，江苏天瑞仪器股份有限公司产品；电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；磁力搅拌加热器，海门市其林贝尔科技有限公司；氮吹仪，北京市优晟联合科技有限公司；超声波清洗器，张家港市神科超声电子有限公司；超纯水机，南京易普易达科学发展有限公司；

甲醇、乙腈、异丙醇、无水乙醇，均为色谱纯，美国TEDIA；

乙醚、氢氧化钾、氯化钠、超纯水，均为分析纯；上海强顺化学试剂有限公司；石油醚，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

胆固醇标准物质，纯度≥99.0%，美国accustandard. 公司提供。

1.2 分析条件

色谱柱：Ultimate XB-C18色谱柱：4.6mm×150mm，5μm，月旭材料科技（上海）有限公司；

流动相：乙腈：异丙醇=85:15

流速：0.6mL／min；

柱温：38℃；

检测波长：208nm；

进样量：10μl。

1.3 标准溶液的配置

标准储备液：准确称取胆固醇标准物质49.38mg（精确至0.1mg），用无水乙醇定容至50ml，配制成987.6ug/ml的储备液，放置于4摄氏度密封可贮藏半年。

标准工作溶液：分别吸取标准储备液1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml，用无水乙醇定容至10ml，配制成98.76ug/ml、197.52ug/ml、296.28ug/ml、493.8ug/ml浓度标准溶液。

图1为浓度为197.52ug/ml的标准溶液色谱图：



图1  浓度197.52ug/ml胆固醇标准溶液色谱图



1.4 样品处理

皂化

      称取油样2g，精确至0.0001g，置于100ml平底烧瓶中，加入30ml无水乙醇，5ml 60%氢氧化钾和10ml水，混匀。将试样在80℃水浴条件下磁力搅拌加热器上皂化回流0.5~1h（以皂化液透明清晰为皂化终点），用5ml乙醇自冷凝管顶端冲洗其内部，取下平底烧瓶，冷却至室温。

提取

      定量转移全部皂化液于250ml分液漏斗中，先用30ml水分两次冲洗平底烧瓶，洗液并入分液漏斗，再用40ml石油醚和乙醚混合液（体积比为1：1）分2~3次冲洗平底烧瓶，并入分液漏斗，振摇2min，静置，分层，转移水相于第二个分液漏斗，再用30ml石油醚和乙醚混合液（体积比为1：1）重复提取两次，弃去水相，合并三次有机相，用5%盐水每次100ml洗涤提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。提取液通过约10g无水硫酸钠脱水，转移至300ml蒸发皿中。

浓缩

    将上述蒸发皿至于氮吹仪上吹干，用5ml乙醇溶解定容，溶液经过0.45微米过滤膜过滤，收集清液于进样瓶中，待色谱仪测定。

2  结果与讨论

2.1流动相的选择

分别考察了甲醇水、乙腈水、乙腈和异丙醇及不同比例，来检测胆固醇，发现甲醇水和乙腈水在检测样品的时候干扰峰较大，对定性定量带来一定难度，所以以乙腈和异丙醇来作流动相，经过不同比例的乙腈和异丙醇来分离杂质峰和胆固醇峰，优化得乙腈：异丙醇=85：15最好，杂质峰干扰最小，峰形最好。在流动相流速上，因为有异丙醇作流动相，粘度大，所以流速选用0.6ml/min。

2.2波长选择

利用二极管阵列检测器，对胆固醇标准品进行三维谱图扫描，发现胆固醇的最佳吸收波长在205nm处，又因为接近溶剂峰的截止波长，基线噪音及漂移比较大，所以选择208nm。

2.3 精密度试验

      取浓度为197.52ug/ml胆固醇标准溶液，连续进样6针，每针10ul，进行测定，考察各组分峰面积的相对标准偏差，结果见表1：



图2 精密度实验谱图

表1  精密度试验结果

Table . 1  Precision of experimental data



组分

峰面积

平均峰面积

相对标准偏差（RSD%）

胆固醇

121271.8

121938.7

1.16

120882.9

120758.5

122108.2

122012.0

124598.7





2.4 线性关系和检测限

      在本方法确定的实验条件下，胆固醇的标准品进样量在50ng ~ 1000ng之间，线性关系良好。



图3线性关系色谱图



图4 线性关系方程

2.5 回收率试验

采用在实际样品中加入不同添加水平的混标的方式进行回收率实验，按 1.4中的方法处理后分析，采用外标法定量，每个添加水平单独测3次，实验结果表明，其平均回收率为为81.04%，RSD为1.15％。 

2.6 实际样品的测试

采用HPLC法测试部分食用油的结果如表3所示。

样品名称

组分含量/（mg.kg-1）

自家菜籽油

色拉油

炒菜剩油

调和油

猪油1

猪油2

胆固醇

未检出

60.85

132.15

65.25

942.5

833.95





表5  样品检测结果



3、结论

      通过对不同动植物油类胆固醇含量的测定，动物油中如猪油中胆固醇含量较高，而植物油中如果是纯正植物油，如自家菜籽油，是没有胆固醇的，而在我们抽查的色拉油、调和油等，均含有一定量的胆固醇。当然这个也不能作为判断油品质好坏的关键指标，但是可以有一定的借鉴意义。
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arvid2007
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2011/11/18 19:07:48 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
这个作为可以怀疑是否地沟油的指标，那要超过多少才可以说是地沟油？
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yuduoling
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2011/11/18 20:04:47 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
地沟油一直是社会的热点
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冷冷的冰雨
xy4585618
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2011/11/19 10:27:51 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
胆固醇含量可以作为地沟油的判断参考标准，能不能对地沟油做一个指纹图谱研究，这样应该是更客观一些
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头像更新中，请稍候…
kaikaifeng
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2011/11/19 11:21:28 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
乙腈：异丙醇=85：15

都用这个流动相了啊
直接用正相柱多好
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arvid2007
arvid2007
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2011/11/19 13:19:09 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 冷冷的冰雨(xy4585618) 发表:
胆固醇含量可以作为地沟油的判断参考标准，能不能对地沟油做一个指纹图谱研究，这样应该是更客观一些

您的意思是用红外光谱图或紫外光谱图吧，这方面好像也有人做过研究
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arvid2007
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2011/11/19 13:19:56 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 yuduoling(yuduoling) 发表:
地沟油一直是社会的热点

的确，是社会的一颗毒瘤啊
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毛毛儿
yangxy12345
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2011/11/21 8:58:02 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 头像更新中，请稍候…(kaikaifeng) 发表:
乙腈：异丙醇=85：15

都用这个流动相了啊
直接用正相柱多好

因为手头没有现成的正相柱，所以将就用了C18
该帖子作者被版主 samanthalas加 10积分， 2经验，加分理由：11月份居民津贴
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毛毛儿
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2011/11/21 9:00:27 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 arvid2007(arvid2007) 发表:
这个作为可以怀疑是否地沟油的指标，那要超过多少才可以说是地沟油？

这个标准不好判断，所以最后没法定论是还是不是地沟油，只是我们自己在做样的时候找了个很有参考意义的，自家的菜籽油来做，胆固醇含量是没有的，而猪油里面胆固醇含量相对来说比较高的，其他的是否真的能判断为地沟油，目前国家也没有一个很好的定论，所以我在这里也不敢搬门弄虎！
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雪妖
czj_1027
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2011/11/21 12:32:38 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
首先恭喜毛毛儿的大作诞生了，O(∩_∩)O~

胆固醇从理论上来说的话，植物油中是不应该有的，动物油中是应该有的，作为一个参考值，这个方法是很好的

继续关注地沟油的其他检测……
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arvid2007
arvid2007
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2011/11/21 21:48:14 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 毛毛儿(yangxy12345) 发表:
原文由 arvid2007(arvid2007) 发表:
这个作为可以怀疑是否地沟油的指标，那要超过多少才可以说是地沟油？

这个标准不好判断，所以最后没法定论是还是不是地沟油，只是我们自己在做样的时候找了个很有参考意义的，自家的菜籽油来做，胆固醇含量是没有的，而猪油里面胆固醇含量相对来说比较高的，其他的是否真的能判断为地沟油，目前国家也没有一个很好的定论，所以我在这里也不敢搬门弄虎！

哦，明白了，这个方法还得进一步完善
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