现想检测血粉蛋白经过蛋白酶水解产物，目标产物是10肽以下水解物，10肽的平均分子量红1200左右，设备只有液相+紫外检测器。需要知道产物里面，不周大小的肽所占的比例（如2肽的，4肽的。10肽）。因为不知道肽的结构，无法用反相色谱定量，不知道用凝胶色谱是否可以得到理想的数据，GPC在相差一个肽的分子量（120）时，是否可以完全分开，什么规格型号的色谱柱较好？

推荐答案：qinxp回复于2011/12/26

楼主，我觉得GPC在相差120分子量时，是很难分离开的。
因为出峰时间和log（Mw）呈线性关系的，相差这么小的分子量，取log后相差更小，建议您选用其他方法，或者预处理。

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2011/12/21 15:33:18 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

你这个太有难度了。
我觉得第一步水解控制都不好做

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2011/12/22 13:36:29 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 liufeilzu(liufeilzu) 发表:
你这个太有难度了。
我觉得第一步水解控制都不好做

就是为了筛选水解条件用的。监测水解程度。

分子量测定的空间排阻色谱法

1、分离原理：根据被分离组分分子的线团尺寸大小进行分离。在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸与与其分子量成比例。

2、固定相：亲水硅胶、多孔性凝胶或经修饰的凝胶[如葡聚糖凝胶（Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶（Sepharose)]和高分子多孔微球，其中最常用的为凝胶，一般分为软质、半软质和硬质凝胶。凝胶的主要性能参数包括平均孔径、排斥极限和分子量范围。凝胶色谱柱的排斥极限（分子量大到不能渗透进入凝胶的任何孔隙）和全渗透点（分子量小到可以进入凝胶的作用孔隙）之间的分子量范围称为该凝胶色谱柱的分子量范围，选择色谱柱时应使试样的分子量落入此范围。

3、分类：根据流动相的不同分为两类，以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透色谱法（GPC）,以水溶液为流动相者称为凝胶过滤色谱法（GFC）。

4、流动相：空间排阴色谱的流动相必须是能够溶解试样的溶剂，同时还必须能润湿凝胶，粘度要低，否则会限制分子扩散而影响分离效果。水溶性试样选择水溶液（包括缓冲溶液）为流动相，流动相的PH值不宜超过色谱柱的耐受范围，一般为PH2-8，流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不超过30%，流速不宜过快，一般为0.5-1.0
mL/min.柱压一般不宜超过5MPa；非水溶性试样选择四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有机溶剂为流动相。

5、系统适应性试验：同高效液相色谱法，包括理论塔板、分离度、重复性、拖尾因子等，但当待测物质的单体与其二聚体分离度不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：

6、测定法

其它可参考现行药典和其它文献。

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2011/12/22 15:24:16 Last edit by xky0230699

有水有渝

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2011/12/22 15:35:43 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

交联葡聚糖凝胶（Sephadex）简介
交联葡聚糖凝胶是将纯化后的线性葡聚糖（a-1，b-吡喃型葡聚糖）与环氧氯丙烷反应，再导入丙三醇侧链而在葡聚糖链间形成交联链，再将所得的凝胶制成直径不同的球形即可。所得三维实体在水中能溶胀而不能溶解。交联度越高，凝胶孔径越小。
Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200每克凝胶膨胀时吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。

各种葡聚糖凝胶的分离范围与用途
Sephadex G-10 葡聚糖凝胶 G-10 分离范围<700 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离。
　　Sephadex G-15 葡聚糖凝胶 G-15 分离范围<1500 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离。
　　Sephadex G-25 葡聚糖凝胶 G-25 分离范围 1000-5000 适用于脱盐、肽与其它小分子的分离。
　　SephadexG-50 葡聚糖凝胶 G-50 分离范围 1500-30000 适用于多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定。
　　Sephadex G-75 葡聚糖凝胶 G-75 分离范围 3000-80000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。
　　Sephadex G-100 葡聚糖凝胶 G-100 分离范围 4000-150000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。
　　Sephadex G-150 葡聚糖凝胶 G-150 分离范围 5000-300000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。
　　Sephadex G-200 葡聚糖凝胶 G-200 分离范围 5000-600000 适用于蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定。

葡聚糖凝胶使用方法
1. 乙醇浸泡：
　　在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;

　　2. 无盐水浸泡：
　　室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；

　　3. 盐酸浸泡：
　　在常温下再用0.2N HCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性；

　　4. 将溶胀好的凝胶脱气后（真空抽滤或超声波）根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；

　　5. 上样前平衡层析柱至少3-5 个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer 的PH值）；

　　6. 凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20% 的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm 以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1 即可；

　　7. 洗脱方法：
　　可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer 中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；

　　8. 在位清洗（CIP）
　　凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h 用1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。

以上内容摘自百度百科。

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2011/12/22 15:40:30 Last edit by xky0230699

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2011/12/22 15:40:34 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

可以加我聊聊，有一款色谱柱专门用于分离复杂酶解样品

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2011/12/23 8:27:13 Last edit by xky0230699

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2011/12/23 8:26:54 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 lugang8023(lugang8023) 发表:
给你个网站，上海精方科学仪器有限公司，他们家做这个很多年了老品牌，服务也很好，有技术问题都会解答的，希望对你有用，给分啊

建议站短知会，不然会被当作广告帖。更希望有相关实际经验的版友进来指教。

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2011/12/23 8:35:33 Last edit by xky0230699

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2011/12/23 9:24:16 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

几款凝胶色谱柱简介

一、TSK凝胶色谱柱：日本东曹公司(TOSOH CORPORATION，以下简称TOSOH)出品
1、TSK-GEL SW系列凝胶色谱柱
TSK-GEL SW系列色谱柱的填料是以刚性的球型硅胶为基质，在其表面通过共价键化学键合亲水基团而成。TSK-GEL SW系列色谱柱的填料具有高性能尺寸排阻色谱所必需的性能，即低吸附性和良好的孔径分布；其pH适用范围为2.5-7.5，可以使用与水完全互溶的有机溶剂，如乙腈、丙酮、甲醇或乙醇等。TSK-GEL SW系列色谱柱适合用于分析分离蛋白质和多肽类样品，其他应用有大量的文献报道。最经常使用的是10μ m 的TSKgelG2000SW，TSKgel G3000SW和13μm的TSKgel4000SW色谱柱；TSK-Gel 2000SWXL和3000SWXL是5μm，TSK-Gel 4000 SWXL是8μm的高效填料色谱柱；分析型色谱柱的结构可以是玻璃或不锈钢材质。
TSK-GEL SW 系列部分色谱柱填料的种类及特性

2、TSK-GEL PW系列凝胶色谱柱
TSK-GEL PW系列色谱柱的填料是亲水而刚性，多孔球型，化学和机械性能都非常优异的聚合物。适用于以凝胶色谱的模式分析分离蛋白质、多肽、多糖、寡糖、DNA、RNA、水溶性的有机聚合物和其他水溶性大分子样品等。TSK-GEL PW系列色谱柱的pH适用范围为2-12，可使用含有50%的混合有机溶剂为流动相，使用温度可达80℃(TSK-gel G-DNA-PW为50℃)。尽管大多数的TSK-GEL PW填料呈微弱的负电性(约5～8μeq/mL)，但是对于分析分离非离子、阴离子和大多数的阳离子型样品没有任何影响。因为TSK-GELPW填料具有非常宽的分离范围，更加线性的校正曲线以及比TSK-GEL SW色谱柱更加低得多的吸附特性，所以TSK-GEL PW色谱柱经常用于分离水溶性的合成聚合物。

相对而言，TSK-GEL SW色谱柱适合于分析分离单分散性的生物大分子，如蛋白等，而TSKGELPW色谱柱则更加适合于如多糖和合成聚合物等多分散性样品的分析分离。

TSK-GEL PW有七种不同孔径的填料，通常分析色谱柱使用的填料粒度是10和17μm，制备柱用的是17，22或25μm。TSK-GEL PWXL系列色谱柱所使用的填料是具有更高柱效的6，10或13μm的填料。混合床层的TSKgel GMPW和TSKGELPWXL系列色谱柱用于分离宽分子量范围，TSKgel G-Oligo-PW和TSKgel G-DNA-PW系列色谱柱则是分离寡糖和DNA或RNA的专用柱。

TSK-GEL PW 系列色谱柱部分填料的种类及特性

二、Shodex色谱柱
日本昭和电工株式会社是日本具有代表性的综合化学会社，从60年代就开始开发液相色谱，已有40多年的生产历史。生产GPC、GPC、糖分析专用柱、离子交换色谱柱、亲和色谱柱、有机酸分析柱等800多个型号的各种专用柱。
1、标准型GPC柱
THF溶剂：最为常用的GPC溶剂，应用范围很广。
三氯乙烷溶剂：应用范围仅次于 THF溶剂。
DMF溶剂：适于极性化合物，如：三聚氰胺树脂、酚醛树脂等的分析。GFC柱SB-800HQ系列和GF系列也可使用DMF溶剂。
柱号后加“L”的线性柱，实现了从高聚物至低聚物分子量校正曲线的广域线性。排阻限相同的色谱柱，一般推荐使用“线性柱”。

水溶性：

油溶性：

2、水溶性、油溶性两用GPC柱

Asahipak GF-HQ系列既可作为GFC柱（水溶性GPC柱），又可作为GPC柱（油溶性GPC柱），打破GPC柱使用常识，是其他品牌无法比拟的GPC柱。以高交联聚乙烯醇凝胶为填充剂，对各种溶剂均有亲合性，同时溶剂注入色谱柱后所造成的收缩膨胀非常小。可使用的溶剂

3、高温/超高温GPC柱
在高温AT-806MS基础上，新增加了HT-800及UT-800系列。HT-800系列是AT-800系列的改进型，UT-800 系列可超温高至210℃的GPC专用柱。分析含超高分子样品时，推荐用UT-800系列。

4、凝胶过滤色谱柱GFC

品牌	填充物	应用
OHpak SB-800 HQ 系列	聚羟甲基丙稀酸脂	很通用的GFC柱，可用于水溶性聚合物、蛋白质和酶的分析。
PROTEIN KW-800 系列	二氧化硅	硅胶骨架、具有适于蛋白质分离的微孔构造。

以上转摘自大连依利特网站

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2011/12/23 10:04:16 Last edit by xky0230699

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2011/12/23 10:05:41 8楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

从技术上可行，但是我还是持保留态度，毕竟分子量小
试试maldi-tof，不分离检测一下

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2011/12/23 11:25:40 9楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 liufeilzu(liufeilzu) 发表:
从技术上可行，但是我还是持保留态度，毕竟分子量小
试试maldi-tof，不分离检测一下

maldi-tof这个设备没有，无法实现。

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2011/12/26 23:03:08 10楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
现想检测血粉蛋白经过蛋白酶水解产物，目标产物是10肽以下水解物，10肽的平均分子量红1200左右，设备只有液相+紫外检测器。需要知道产物里面，不周大小的肽所占的比例（如2肽的，4肽的。10肽）。因为不知道肽的结构，无法用反相色谱定量，不知道用凝胶色谱是否可以得到理想的数据，GPC在相差一个肽的分子量（120）时，是否可以完全分开，什么规格型号的色谱柱较好？

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