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主题：【分享】PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP)

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去年冬天

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发表于：2012/02/18 12:05:11 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型
背景知识：这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。
主体内容：
第一天
一、胶块的制备
1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬
浊液（CSB）；
2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；
3、在模具上标记好对应样品的名称；
4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，
用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。
5、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵
育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。
6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl蛋白酶K（储存液浓度为
20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。
7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。
8、在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻
混匀。
9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。
注意事项：
（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
（3）在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。
（4）混合物加入模具时不能产生气泡。
（5）在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。

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2012/2/18 12:05:29 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

二、细胞的裂解
1、在50ml的screw-cap tube上做好标记。
2、配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25µl蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。
注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。
3、每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。
4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。
（1）可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。
（2）一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。
5、保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。
7、将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块
1、从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉
CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。
注意：
把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。
2、每管中加入15ml预热的纯水。
3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。
4、倒掉水，用纯水再洗一次。、
5、倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。
6、倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。
7、倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。
注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。

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2012/2/18 12:05:41 Last edit by 7336167

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2012/2/18 12:06:23 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

四、胶块内DNA的酶切
1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。
2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。
试剂 µl/胶块 µl /10胶块
纯水 180µl 1800µl
Buffer D 20µl 200µl
总体积 200µl 2000µl
注意：缓冲液要置于冰上。
3、在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H的稀释液。
4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。
5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。
6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。
7、将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。
8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。
试剂 µl/胶块 µl /10胶块
纯水 175µl 1750µl
Buffer D 20µl 200µl
酶（10U/µl） 5µl 50µl
总体积 200µl 2000µl
注意：
（1）将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。
（2）用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。
9、每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。
10、在37℃水浴中孵育至少2小时。

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2012/2/18 12:06:46 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

五、加样
（一）将胶块直接粘在梳子齿上
1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使
其水平。
2、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
3、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。
4、每管加入200µl 0.5×TBE。
5、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳
子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。
6、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。
7、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面
相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。
8、记录加样顺序。
（二）将胶块直接加在加样孔内
1、调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶
槽使其水平。
2、把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在55℃－60℃平
衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。
3、小心拔出梳子。
4、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。
5、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。
6、每块胶加入200µl 0.5×TBE平衡。
7、用小铲将胶块加入加样孔。
8、用溶化的胶封闭加样孔。
注意：
a) 可以在加样孔中加入0.5×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。
b) 记录加样顺序。

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2012/2/18 12:07:32 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

六、电泳
1、确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触
碰电极。
2、加入2.2L 0.5×TBE,关上盖子。
3、打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）
和缓冲液在管道中正常循环。
4、打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右）。
5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。
6、设置电泳参数。
7、记录电泳初始电流（通常120－145ma）。
8、结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。
第二天
七、图像的获取
1、取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，
1：10,000稀释，即在400ml水中加入40µl储存液）。
注意：
EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。废弃的EB溶液应妥善处理。
2、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。
3、放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。
4、戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加
入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。
5、用Gel Doc 2000拍摄图像。
注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。
6、转换成*.1sc文件用于处理分析。
八、数据的分析

图像的读取

电泳图像通常用BIO-RAD的GEL DOC2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力≥768 x640像素，能够用BioNumerics software (Applied Maths,Inc.)软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。

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2012/2/18 12:08:37 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

名称：免疫组化标准操作规程(SOP)
关键词：免疫组化
目的：规范免疫组化操作
主要步骤:
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
(2)煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
(3)微波热修复在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，ChromograninA，Cyclin，ER，Heat shockprotein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
2)酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
3、免疫组织化学染色步骤
Elivision Plus 法（二步法）
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）抗原修复；（视具体抗体情况决定是否要做修复，本抗体PCNA不需修复）；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟，以阻断内源型过氧化酶；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）甩去PBS液，滴加Ⅱ抗聚合物增强剂40～50μl，室温静置，或37℃半小时；
12）PBS洗3次各5分钟；
13）甩去PBS液，滴加酶标抗鼠/兔聚合物40～50μl，室温静置，或37℃半小时
14）PBS洗3次各5分钟
15）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
16）PBS或自来水冲洗10分钟；
17）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
18）自来水冲洗10～15分钟；
19）脱水、透明、封片、镜检。

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