主题：【分享】基因工程的操作步骤

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发表于：2012/04/21 10:32:35 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

第一步：目的基因的制取:

用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切，产生一系列大小不等的DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因，是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。

目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法.

第二步：基因载体的选取:

用人工方法，取得目的基因的适宜的载体，即质粒（一种环状双链DNA）或病毒。载体一般带有必要的标志基因，以便进行检测。

基因克隆载体必须具备三个条件：
a.具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。
b.能携带外源DNA进入受体细胞，或游离在细胞质中进行自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。
c.必须具有选择标记，承载外源DNA的载体进入受体细胞后，以便筛选克隆子。

基因工程的基本过程(点击放大)

第三步：DNA的体外重组:

即用人工方法，让目的基因与运载体相结合，首先要用限制性内切酶和其他一些酶类，切割或修饰载体DNA和目的基因，然后用连接酶将两者连接起来，使目的基因插入载体内，形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行，所以基因工程操作又叫体外DNA重组。

第四步：DNA重组体导入受体细胞:

将外源DNA片段与载体DNA连接形成DNA重组体，即重组DNA。

这种重组体连接的方法主要有：

粘性末端连接法：应用同一种限制性内切酶切割载体和外源DNA分子，可产生相同的粘性末端（接口处的碱基互补），进一步用DNA连接酶将断口连好，即可获得重组DNA分子。

DNA重组体导入受体细胞

钝性末端连接法：用化学合成法或逆转录法得到的外源DNA片段，均为钝性末端，这种末端也可以用特殊的连接酶连接，但效率太低。通常需要用人工方法加上粘性末端，再进行连接。

第五步：受体细胞的繁殖扩增:

含重组DNA的活受体细胞，再在适当的培养条件下，并进行繁殖和扩增，使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加。

第六步：克隆子的筛选和鉴定:

受体细胞经转化（传染）或传导处理后，真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分，而绝大部分仍是原来的受体细胞，或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子，需要对克隆子进行筛选和鉴定。

第七步：目的基因的表达。