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主题：【分享】食品中内毒素、菌的检测【图文并茂】

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发表于：2012/04/21 12:02:13 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

食品中大肠菌群测定检验程序

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2012/4/21 12:02:41 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

细菌内毒素标准品为基准物进行标定，确定基重量的相当效价。每1mg工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU，并具备均一性和稳定性的实验数据。效价测定方法如下：每批工作标准品至少取4支样品，使用同一批号鲎试剂、同1支标准品。每支工作标准品按重量、标准品按单位，分别用内毒素检查用水＊稀释制备一系列2倍稀释度的内毒素溶液，与鲎试剂反应，当4支工作标准品的反应终点的对数均值的标准差（S）小于0.365时，计算4支工作标准品的反应终点的几何平均值（以ng/mg表示）及标准品的反应终点值以（以EU／mg表示），按下式计算。

　　（二）试验准备本法所用的器皿需经处理，除去可能存在的外源性内毒素常用250℃干烤30分钟或180℃干烤2小时，也可用其他适宜方法。试验操作过程应防止微生物的污染。

　　试验前需核对使用批号鲎试剂的灵敏度标示值，应符合规定。装量加入配带的鲎试剂溶剂。溶解后，为鲎试剂溶液，备用。

　　供试品的稀释：使用批号鲎试剂的灵敏度标示值小于供试品的内毒限量时，按下式计算，用内毒素检查用水＊将供试剂品稀释后进行检查。

　　供试品的稀释倍数＝X／λ

　　X：供试品的内毒素限量内毒素限量（EU／ml）

　　λ：供试品鲎度剂灵敏度标示值（EU／ml）

　　(三)检查装有0.1ml鲎试剂溶液的10×75mm试管（或0.1ml／支规格的鲎试剂原安瓿）4支，其中2支加入0.1ml供试品作为试品管，1支加入2λ内毒素工作标准品0.1ml作为阳性对照管，1支加入配带的鲎试剂溶液0.1ml作为阴性对照管。将试管轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中，保温60±2分钟。保温过程和拿取试管要小心，避免因受到振动造成阴性结果。

　　（四）结果判断将试管从水浴中轻轻取出，缓缓倒转1800时，管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性记录为（＋）凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。供试品2管如为（一），应认为符合规定，不再进行热原检查法（家兔法）试验。如2管均为（＋），应认为不符合规定。如2管中1管为（＋），1管为（一），按述方法另取4支供试品管复试，4管中有1管为（＋）即认为不符合规定。除正文另有规定外，有符合规定的供试品应再以热原检查法（家兔法）试验，并根据的结果判定。

　　供试品细菌内毒素的限量应符合各品种正文下的规定。

　　阳性对照为（一）或阴性对照为（＋），试验无效。

　　附灭菌注射用水、注射用水、氯化钠注射液、5％和10％葡萄糖注射液细菌内毒素检查。

　　【细菌内毒素】取本品，依法检查，供试品细菌内毒素的限量不应超过1EU／ml。如超过1EU／ml，需经热原检查法（家兔法）判定。

鲎试剂标准

　　本品为鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品。

　　本品含能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原，凝固蛋白原其灵敏度以细菌内毒标准品或工作标准品测定，应为标示量的50％－200％。

　　（一）性状本品为白色或类白色冻干块或粉末，在水生生理盐水中易溶。

　　（二）鉴别

　　1．取本品按装量加水溶解后，加茚三酮试液《中国药典1990年版》（二部附录162页）0.25ml，加热煮沸1－2分钟，显蓝色紫色。

　　2．取本品按装量加水溶解后，再加水适当稀释，照分光光度法《中国药典1990年版》（二部附录24页）测定，在270±1nm的波长处有单一吸收峰。

　　3．取本品按装量加入内毒检查用水溶解后，吸取0.1ml加入0.1ml细菌内毒素工作标准品或标准品50EU，混匀后，于37℃水浴中放置1小时，有凝胶形成。

　　（三）检查干燥失重：取本品约0.1在g ，在66℃减压干燥至恒得，减失重量不得过5％（中国药典1990年版二部附录55页）。

　　自身凝集：取本品4支，按装量加入配带的鲎试剂溶剂，溶解后，分别从每支取0.1ml，再分别加入配带的鲎试剂溶剂0.1ml，混匀后，于37±1℃水浴中放置4小时，不得形成凝胶，若有2管以上形成凝胶，判为不合格；若仅有1管形成凝胶，照同样方法，另取8支重复检查，8支均不得形成凝胶。

　　缓冲能力：任意取5％、10％葡萄糖注射液，氯化钠注射液无菌注射用水或注射用水适量，加稀盐酸调节pH使供试品溶液pH值为2.90-3.00，取此溶液适量与等量鲎试剂溶解液混匀，重复测定，pH值应为6.00-8.00。

　　（四）灵敏度测定预测：

　　1．取细菌内毒素工作标准品1支，按说明溶解燕稀稀释成1→8等比系列稀释液。

　　2．取同一批鲎试剂若干支，分别按标示量加入配带的试剂溶剂制成鲎试剂溶液。取10×75mm试管若干支，分别加入0.1 ml鲎试剂溶液，加入内毒素稀释液0.1 ml ，每一稀释液最少作2管，同时作2管阴性对照。轻轻振动上述试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃水浴中。保温60±2分钟观察结果，确定本批鲎试剂灵敏范围，2管阴性对照不得出现阳性结果。

　　测定：根据预测得到的灵敏范围，将细菌内毒素工作标准品以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个边疆稀释液，每一稀释液作4管，且其最高浓度的4管应均为阳性最低溶液的4管应均为阴性，同上述操作，记录反应结果，计算标准差（s）

X为4组反应终点的数对值,n为4

当s＜0.365时，按下式计算本批鲎试剂灵敏度（λ）

　　当s＜0.365时测定无效，应检查出现差异原因，并重新测定。

　　（五）用途用于细菌内毒素检查。

　　（六）规格（1）0.1ml；（2）0.5ml。

　　（七）贮藏遮光，在冷处保存。有效期暂定1年。

　　*系指其内毒素含量不超过0.006EU/ml的注射用水。

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2012/4/21 12:03:37 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

食品中大肠菌群测定检验程序

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2012/5/9 10:58:31 Last edit by gl19860312

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2012/4/21 12:04:48 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

食品中菌落总数和大肠菌群的检测

(一〕实验目的

(1)了解和学习食品中菌落总数和大肠菌群检测的意义。

(2)学习和掌握食品中菌落总数和大肠菌群的检测方法。

（二)实验原理

食品的微生物学指标主要包括菌落总数、大肠菌群和致病菌等三个项目。其中菌落总数和大肠菌群是最重要、最常检的检验项目。

检测食品中的菌落总数，可以了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况．从而反映食品的卫生质量。一般来说、菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量存在时，病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在。但上述规则也有例外，有些食品成品的菌落总数并不高，但由于已有细菌繁殖并已产生了毒素，且毒素性状稳定，仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等，本身就是通过微生物的作用而制成的，且是活菌制品。因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用，但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生质量，还必须配合大肠菌群和致病菌等检验，才能作出比较全面、准确的评价。

大肠菌群是水源污染的指示菌，当饮用水中检查出大肠菌群时，即证实水已被粪便污染，对人是有害的，是不卫生的。同样，食品中若有大肠菌群存在，也会影响人的健康。

本实验主要介绍食品中菌落总数和大肠菌群的检测方法。

(三)实验器材

(1) 菌落总数的检测：

1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

2)试剂：75％乙醇，无菌生理盐水等。

3)器材；直径为9cm的平皿，18mm x 200mm试管，1mL和10mL吸管，500mL三角瓶，500mL广口瓶，均质器或乳钵，培养箱、恒温水浴锅等。

(2)大肠菌群的检测：

1)培养基；乳糖胆盐发酵管，乳糖发酵管，伊红美蓝琼脂培养基(EMB)(见实验103)。

2)试剂：革兰氏染色液等。

3)器材：平皿，试管，发酵管，吸管，三角瓶，广口瓶，均质器或乳钵，培养箱，恒温水浴锅等。

（四)实验方法

(1)菌落总数的检测

1)检样稀释及培养：

①以无菌操作法，将检样25g(或25mL)剪碎以后，放于装有225mL无菌水的三角版(瓶内预先放适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成l：10的均匀稀释液。

固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌容器中以8000-10000r／min的速度离心1min，做成1：10的均匀稀释液。

②将上述样品进行10倍系列稀释，稀释度视食品性质和污染状况而定。

③根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。

④迅速将熔化后保温在45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15—20mL注入平皿，并转动平皿使混合均匀，同时将培养基倾入加有1mL空白稀释剂(即不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。

⑤待琼脂凝固后，倒置平板，于36±1℃恒温箱内培养48±2h取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得lg(1mL)样品所含菌落总数。

2)菌落计算方法和报告：

同实验一0七水中菌落总数测定方法中的菌落计数报告方式。

(2)大肠菌群的检测：

1)检验程序：

食品中大肠菌群检测程序见图l08—1所示。

2)操作步骤：

①采样及稀释：

a．按无菌操作法将检样25g(或25mL)放于含有225mL无菌水的三角瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000-10000r/min的速度离心1min，做成1：10的稀释液。

b．用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1Ml，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀释液。

c. 根据食品的卫生要求或对检验样品污染情况的估计，选择三个稀释度，

图1 食品中大肠菌群的检测程序每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。 ②乳糖初发酵试验：即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。．将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管；lmL及1mL以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管。每一个稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。③分离培养：将产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置36±1℃温箱内培养18-24h，然后观察菌落形态并作革兰氏染色、镜检并作复发酵试验。 ④乳糖复发酵试验：即通常所说的证实试验，其目的在于证明经乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。在上述选择性EMB培养基上，挑取可疑的大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±l℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。凡乳搪发酵管产气，革兰氏染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠菌群阴性。

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