5.预柱(保护柱)
在实际的
液相分析中,由于的复杂性,流动相洗脱能力等原因,都会不可避免地使
液相分析柱所到损伤(如,柱被堵、固定相被严重污染),影响分析效果与柱的使用寿命。在众多的实际应用中,柱的损伤主要集中于柱进口端1-2cm的距离上。虽然可以去除这部分固定相,然后重新填充。但方法繁琐(
液相填柱为匀浆高压填装,一般单位难以实现),且修复后的柱子整体柱效下降,分离能力变差,柱的各项分离参数也发生了变化。这一点将导致柱修复前后的分析结果失去可比性(即修复前后的数据是不关联的,定性、定量、重复性都失去了比较的基础)。而在分析柱前添加保护柱后,能避免上述缺陷,获得良好的分析结果。
保护柱是根很短的(2cm左右)柱芯,柱芯两端有烧结滤板,内部填装有与分析柱相同的固定相,整个柱芯装于一段空心柱管内,类似于分析柱的结构。当柱芯损伤时,柱芯是可以很方便地从空心柱管内取下予以更换的。其优点在于:
1、 柱芯更换方便,对整个色谱系统的分离参数影响很小。
2、 在某些情况下,随柱芯内填物的改变,可做预处理柱或反应柱(如柱前衍生、柱前预饱和处理)。
6.检测器
检测器HPLC系统中也是主要的核心部件之一,它将样品混合物从色谱柱上分离出来的各单独组分按比例地响应出来,从而完成分析工作的目的即定性与定量。从某种程度上讲,它的重要性并不亚于色谱柱,相当于人类的“眼睛”,所有的分离信息将从这儿获取。
检测器种类较多,但基本上它们的检测机理都是相同的:即依据样品组分的物理或化学特性的差异,将这些特性差异转变为能方便测取的电信号。电信号经处理后绘制成谱图,便于分析人员进行样品的定性、定量工作,并依据分析数据调整分析条件或指导相关的生产、研究工作。
目前市场上仪器化生产的
液相检测器及其检测原理间例如下:
序号 检测器 原理 备注
1 紫外-可见光 利用样品对紫外光的吸收 应用广泛。局限:被测组分能吸收或被动吸收(经衍生化处理)紫外光。可梯度洗脱。灵敏度高
2 示差折射 利用样品对光的折射率差异 通用型,灵敏度低。
3 荧光 利用样品组分受光激发后会产生荧光的特性 局限:被测组分能产生或被动产生(经衍生化处理)紫外光。灵敏度非常高
4 电化学 利用组分的电性(如电导、电量)来计量 较为成功的是安培检测器,常用于
离子色谱仪器。
5 蒸发光散射 利用样品颗粒对激光束的散射程度 通用型。类似于示差折光,但灵敏度非常高。可梯度洗脱。
上述简单枚举的5种
液相检测器,是在实际应用过程中筛选出来的,能基本涵盖所有的
液相分析的需求,各检测器各有优缺点与局限性。作为实际应用中,使用最为广泛的检测器-紫外---可见光检测器几乎是所有
液相色谱仪器必备的检测器,
7.术语
A, 基线(Baseline):指正常的操作条件下,仪器系统(热平衡、静电平衡、柱流出溶剂均一)后,柱上流出物经过检测器所产生的响应信号曲线。理论上稳定的基线是一条光滑平整的直线,该直线应与时间轴平行,如图中AP线。
B, 噪声(Noise):在基线的局部放大部分,基线并不是一条理想的光滑平整的直线(即无组分流出时,响应信号不能恒定如一),而是随时间的变化在一个很小的范围内非常频繁地上下抖动的曲折线(即由于各种微平衡在被打破与达成平衡间反映出来的信号变化),这条曲折线称为噪声,记为Noise。噪声从根本上表征了整个分析系统的平衡情况与系统好坏。影响噪声大小主要有柱的好坏,溶剂的好坏,系统死体积大小,仪器电子元件部分的好坏,仪器部件(如流路结构、泵及检测池与光路的设计)的科学性,当然也包括信号的传送与处理。总之,它体现了系统的整体运行情况。噪声分短期噪声Nd(1-2min以内)与长期噪声Nc(10-20min以上)。一般来讲,Nd主要由分析系统本身的电路元气件部分的平衡造成的;Nc则是更多地反映了分析系统中柱平衡、溶剂变动(流量脉动、溶剂比例变化、溶剂流型异常)情况。
C, 漂移(Drift):基线除了不光滑外,它也并不平行于时间轴,会随时间缓慢地发生偏离水平线的变化。一般以0.5-1.0小时内偏离起始点的幅度大小来加以度量,定为漂移,记作D。我们希望D小,并且是单方向漂移,这对于定量工作是非常重要的。漂移或上或下,说明系统偏离平衡,严重时需要及时排查原因,予以更正,否则将影响正常分析工作的开展。
D, 保留时间(Reserve)tR:它指样品组分在分离系统(主要是柱中)的滞留时间。时间的长短取决于组分在二相交互区间的分配平衡过程,与柱内固定相作用(易吸附于固定担体、溶解于固定液或形成离子对,总之容易“粘”在固定相上,就越难被重新洗脱下来)大的,其保留时间就会越大;反之越小。这一分配平衡主要由组分、固定相、流动相间的热力学性质控制。因此,在同一色谱条件下,任何一种组分都有其确定不变的保留时间,这是谱图得以定性的基础。当然组分有可能在特定条件下拥有相同的热力学参数,从而会有一样的保留时间。总之,同样组分必定有一样的保留时间;但保留时间相同的谱峰并不一定是同一组分。
**注,同一色谱条件指前后进样的分析条件(仪器、柱、流动相、仪器参数)不变,所不同的仅是重新注进的样品而已。
E, 死时间(Dead time)tO:即不参与分离分析的那部分体积,可以由不被柱内固定相作用的物质来测取。在HPLC中,死体积包括柱前(至进样阀)后(至流过池)连接管路体积,柱外体积、柱填料间隙体积、流过池体积等。死时间如图tO峰,通常表现为进样扰动峰(样品溶剂与流动相不同时尤为明显)。死体积的存在会使分离效果严重下降,因此必须尽量减小。理论上应在柱头进样,柱后即被检测,使剩下的体积即柱子成为唯一的、参与分析过程的有效体积。
F, 调整保留时间t`R:指保留时间中扣除不参与分析过程而浪费的那部分死时间tO后的有效时间,记为t`R。t`R是真正起分析效用的时间。t`R= tR -tO
G, 比保留时间/相对保留值r12:指某两个组分的调整保留时间的比值,r1 2=t`R 2 /t`R 1 比保留值是组分定性的重要参数,对于分析解读谱图更为有用。其优点在于只要固定相与柱温(热力学环境)不发生变化,流动相比例恒定,即使其他参数变化(柱长度、柱床情况、流速),它的比保留时间值也是始终一致的。r值也表征了分离的情况。
H, 峰底:指峰的起始与结束点间的连线如DF,峰的起始点与结束点的判定由工作站依据曲线上各点的切线(一次导数为0)与水平线间夹角θ的大小来判断。/Tgθ/<X,峰的起点;/Tgθ/>X,峰的落点。X称切线的斜率值,其值大小一般为默认值(如70),当然也可以依据分析人员的判断加以调整。
I, 峰底宽Y:即由峰两侧拐点JK(二次导数为0)处的切线交于基线的N、O两点间的距离即NO,拐点位于峰高的0.607倍的地方,拐点间距JK为曲线标准偏差值的2倍,NO=4σ。
J, 峰高h:峰顶点到基线的距离。
K, 半峰宽W1/2:位于峰高一半处的镫宽度如LM。其大小表征了物质传质的动力学因数。
L, 峰面积A:指由曲线GLJHKMIONG围成的面积。