主题：探讨水华中藻类及其毒素

藻类纯化培养干脆买纯的藻种了，武汉水生所应该用

以前网上找的，希望有帮助
微囊藻毒素的资料

一、概述
随着社会工业化进程的加快，人类在工农业生产及日常生活中，向水体排入大量含氮、磷的污染物，加速了湖泊的富营养化(Eutrophication)，藻类(Algae)由此而获取丰富的营养而大量繁殖。最近的调查表明，亚太地区54%的湖泊富营养化，欧洲、非洲、北美洲和南美洲的比例分别是53%，28%，48%和41%，我国则是60%。
在富营养化的淡水水体中，当有适宜的化学物理条件时，水体中的藻类短时间内大量繁殖并聚集的生态异常现象称为水华（Water Blooms, 也称湖靛）；这一现象若发生在海洋里则通常称为赤潮（Red Tide）。淡水水体富营养化危害最大的一个表征是水华的出现，每年夏、秋季节，在一些淡水湖泊均会形成大量水华，致使水质日趋恶化。
当水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖靛所覆盖，甚至在岸边大量堆积。在藻体大量死亡分解的过程中，不但散发恶臭，破坏景观；同时大量消耗水中溶解氧，使鱼类窒息死亡；尤其是藻类能释放生物毒素——藻毒素(Algae Toxins)，这些类次级代谢产物严重危害人类和其他生物的安全。随着富营养化的加剧，藻类水华发生的频率和幅度也增加，有毒水华对水环境的危害和生物安全更日益引起广泛的关注。
淡水中蓝绿藻属(Cyanobacteria，Blue-green Algae)分泌产生的蓝藻毒素是目前已经发现的污染范围最广，研究最多的一类藻毒素。其中的微囊藻毒素LR (Microcystin-LR)是目前已知的毒性最强的、急性危害最大的一种淡水蓝藻毒素。
由于未及时地检测水质情况的污染变化及采取相应的控制措施，致使这些毒素富集于鱼类或贝类中并通过食物链传递，直接存在于饮用水或娱乐用水中，严重威胁人类的健康，全球已经发生了多起有关藻毒素中毒并引起死亡的事故。近年来淡水藻类污染已成为一个全球性的环境问题。
目前，为了保障人民的身体健康，我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范（2001，0.001mg/L）和地表水环境质量标准（GB3838-2002。微囊藻毒素-LR，0.001mg/L）都包含了微囊藻毒素的检测项目；世界卫生组织(WHO)在其推荐的饮用水标准指导（第二版）中也增加了微囊藻毒素（MC-LR, 1ug/L）等指标（WHO. 1998），其中都有关于微囊藻毒素LR的检测。
目前对水体中藻毒素的检测技术研究还比较落后。大多数藻毒素使用价格昂贵、体积庞大的HPLC-MS或GC-MS检测，样品制备过程复杂、耗时长，需要专业技术人员操作，检测费用很高。因此限制了常规监测次数。近年来，美国、德国和日本等国家的科学家运用免疫技术结合计算机、传感器技术，研究水中藻毒素（尤其是微囊藻毒素-LR）的原位免疫检测方法。通过对居民生活饮用水水质的监测，为居民的身体健康提供保障，为控制和去除水体中的藻毒素提供帮助。
二、微囊藻毒素的分子结构
微囊藻毒素是一组环状七肽，一般结构为：
环(-D-Ala-L-X-D-Masp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)
其中：L为左旋；D为右旋。
Masp(有时写作MeAsp)为Ｄ-赤-β-甲基天冬氨酸；
Adda为(2s,3s,8s,9s)-3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯酸；
Mdha为Ｎ-甲基脱氢丙氨酸。
X和Z为两种可变的L-氨基酸，目前已发现下列三种XZ组合的藻毒素毒性较大：LR、RR和YR，其中L、R、Y分别代表Leu(亮氨酸)、Arg(精氨酸)和Tyr(酪氨酸)。2、4位氨基酸也是微囊藻毒素命名的依据。
构成环状七肽的七个氨基酸，其中5个是非蛋白质氨基酸，2个(2、4点位)是蛋白质氨基酸。由于XZ的不同及Masp和Adda的甲基化或去甲基化产生的差异，可以形成多种不同的微囊藻毒素异构体。目前已从不同微囊藻菌株中分离、鉴定了60多种微囊藻毒素结构。目前已知存在的最普遍、含量相对较多，毒性较大的是主要是MC-LR，MC-RR，MC-YR等数种，这几种也是可商品购买的。

图1　微囊藻毒素-LR的分子结构图
Fig.1  Molecular structure of microcystin-LR
三、物理和生化性质
藻毒素具有水溶性和耐热性。易溶于水，甲醇或丙酮，不挥发，抗pH变化。MC-LR的分子式为C49H74N10O12，分子量为995.2（计算时往往按1000计），分子结构图如图1所示。
其在水中的溶解性大于1ｇ/Ｌ，化学性质相当稳定。在水中藻毒素自然降解过程是十分缓慢的，当水中的含量为5ug/Ｌ时，三天后，仅10%被水体中微粒吸收，7%随沙沉淀。藻毒素有很高的耐热性，加热煮沸都不能将毒素破坏，也不能将其去除；自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯也不能将其去除。有调查试验研究表明在某湖周围3个自来水厂的出厂水中检出低浓度的藻毒素(128～1400ng/L)，结果提示采用常规的饮水消毒处理不能完全消除水体中的藻毒素。

它是一种肝毒素，这种毒素是肝癌的强烈促癌剂。
家畜及野生动物饮用了含藻毒素的水后，会出现腹泻、乏力、厌食、呕吐、嗜睡、口眼分泌物增多等症状，甚至死亡。病理病变有肝脏肿大、充血或坏死，肠炎出血、肺水肿等。
对于人类健康，微囊藻毒素也具有很大危害性。其中MC-LR的半致死剂量（LD50）约为50~100 ug/kg。人们在洗澡、游泳及其他水上休闲和运动时，皮肤接触含藻毒素水体可引起敏感部位(如眼睛)和皮肤过敏；少量喝入可引起急性肠胃炎；长期饮用则可能引发肝癌。医学部门已发现饮水中微量微囊藻毒素与人群中原发性肝癌的发病率有很大相关性。1996年在巴西造成100多名急性肝功能故障，7个月内至少50人死于藻毒素产生的急性效应，引起举世瞩目的关注。淡水水体中的蓝藻毒素已成为全球性的环境问题，世界各地经常发生蓝藻毒素中毒事件。

四、微囊藻毒素的危险评价及控制标准
既然水体中的蓝藻毒素对人类具有潜在的危害，就有必要对水体中的蓝藻毒素进行危险评价。
目前尚没有强制性的饮水中藻毒素含量卫生标准，各国已有饮水中的藻毒素含量标准一般都为微囊藻毒素-LR的含量。世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的藻毒素标准为1.0ug/Ｌ，加拿大健康组织规定饮水中可接受的藻毒素标准为0.5ug/Ｌ（Guidelines for Canadian Drinking Water Quality, 1993），澳大利亚学者建议1μｇ/Ｌ的含量为安全饮用水的上限。我国尚未制定饮水中微囊藻毒素含量标准，在即将颁布的生活饮用水卫生规范中已将微囊藻毒素-LR的标准值列入，参照WHO标准，定为0.001ｍｇ/Ｌ。
根据表1的数据，我们可以推测，那些饮用未经处理的地表水的人群有摄入蓝藻毒素的危险，特别是在蓝藻水华发生的高峰季节。由此，可以看出蓝藻毒素对发展中国家，特别是农村地区的人群比发达国家的人群具有更高的危险。但是，饮用经处理的地表水的人群并非就没有摄入蓝藻毒素的危险了，因为目前传统的水处理方法在去除蓝藻毒素方面效果并不好。无论对哪一类人群，儿童和婴儿均比成人具有更高的摄入蓝藻毒素的危险。
表1　饮用水中蓝藻毒素的最高允许含量　μg•L-1
蓝藻毒素 婴儿1) 儿童 成人
微囊藻毒素 0.20 0.29 0.88
微囊藻毒素-LR  2) 0.07 0.11 0.32
1)婴儿、儿童和成人的体重分别按5、10、60kg计，每日饮水量分别按0.75、1、2Ｌ计；
2)由口服给药所得结果；
五、微囊藻毒素的检测方法
现在对水体中微囊藻毒素的检测已发展了多种分析方法，主要有生物分析法、化学分析法和生化分析法。
5.1 生物分析法
传统的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂评价微囊藻毒素的毒性。
用纯化的微囊藻毒素或水华蓝藻中粗提藻毒素进行测试，根据其生理病变及半致死量可初步确定其毒性(除个别异构体的LD50为200～250μg/kg，多数微囊藻毒素的LD50为60～70ug/kg)。这也是毒理评价的常用方法。此外还有用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价的研究，以细菌进行生物分析也有报道。这类方法灵敏度较差，所得到的毒型结果与小鼠的品系有关，可比性较差，且无法确定毒素类型及结构。但该方法操作简单，且可以监测到过去未曾发现的新毒素。
5.2 化学分析法
化学分析法主要包括气相色谱 (GC)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱/质谱分析(LC/MS)及毛细管电泳(CE)等，其中HPLC应用最广。这些方法利用微囊藻毒素的物化性质结合灵敏的光电技术对其进行定性、定量分析。
（一）、高效液相色谱(HPLC)
液相色谱可以分析一些气相色谱无法分析的挥发性差、极性强、热稳定性差的物质。常用的检测器有紫外-可见光（UV-VIS）(ultraviolet- visible)检测器、示差折光检测器、荧光、化学发光检测器、火焰离子化检测器和电化学检测器等。
HPLC技术一般采用正相或反相色谱柱对毒素进行分离，然后进行紫外(UV)、荧光(FL)或化学发光(CL)检测。将被测毒素与标准毒素的滞留时间进行比较可对被测毒素进行鉴定，将被测毒素与标准毒素的峰面积进行比较可对其进行精确定量。目前常采用HPLC/UV法对MC进行监测，监测限度一般为ng级。
高效液相色谱是目前应用、研究较多的方法，这一方面取决于微囊藻毒素本身的物理和化学性质，另一方面也因为该法有良好的灵敏度(可达0.1μｇ/Ｌ)和选择性。其步骤是先将水华蓝藻的毒素提取液或实际水样通过固相萃取吸附富集，溶剂淋洗后将净化的微囊藻毒素洗脱，用于定性分析。用于色谱分析。同时，可利用液相色谱的特点，与质谱或核磁共振联用确定其分子式和结构。
（二）、LC/MS
HPLC监测技术往往需要标准毒素，而目前已发现60多种MC，多数缺乏标准毒素，这限制了HPLC的进一步应用。LC/MS技术很好地解决了这一问题，即使没有标准毒素，只要知道这种毒素的分子量，就可对其进行定性，而且LC/MS技术亦可对毒素进行精确定量。快速原子轰击质谱(FABMS)和液相次级离子质谱(LSIMS)是确定毒素分子量的有效手段。
（三）、气相色谱法(GC)
气相色谱法的一次进样可以对多种物质混合样品的各个组分进行定性、定量分析。气相色谱法的优点是操作简单、分离效能高、选择性强、分析速度快。局限性主要表现在如果没有标准样品对照，就无法定性分离组分。用于气相色谱法的检测器多达十几种，如电子捕捉检测器、氢火焰离子化检测器、碱离子化检测器等。其中电子捕捉检测器只对具有电负性的物质（卤素、硝基、氧原子等化合物）有响应，而且选择性强、灵敏度高，广泛应用于有机氯农药和其它含有电负性原子的农药残留检测。
气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术已经比较成熟，结合了气相色谱分离特性强和质谱仪良好的定性能力，使分离、定量和定性同时进行。但是它的局限性在于只适合于分析可以气化的样品。目前高分辨气相色谱-高分辨质谱仪（HRGC-HRMS）（High Respective）技术可以检测到单位体积内几个fg的量。如此高的检测灵敏度也会带来一些问题，因为样品可能很快会被接触到的玻璃容器、试剂甚至是实验室的空气所污染。
GC和GC/MS可用于MC总量的测定。

最近又发展了毛细电泳(CE)法。后者分析速度快、具有柱上富集功能并应用激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, LIF)检测器提高灵敏度。此外，同生化检测法相比，CE易于实现自动化，避免了放射性物质。TLC也是有效的毒素监测手段，易于操作，不需特殊设备，监测限度可达ng级，但在监测的灵敏度方面要逊色于HPLC。
5.3 细胞毒性检测技术
细胞毒性检测技术是利用毒素对细胞的毒性作用来监测毒素的一种技术，不仅可以判断毒素存在与否，而且可以对毒素进行精确的定量。这种方法监测的也是能发挥相同毒性作用的毒素的总量。
Fladmark等建立了一种根据MC导致鲑鱼或大鼠肝细胞凋亡的程度来确定MC的方法。他们将分离的鲑鱼或大鼠的肝细胞悬浮培养，然后加入MC，根据细胞凋亡的程度即可求出MC的含量，监测限度为10～20ng。
动物细胞凋亡的第一个信号是发生凋亡的细胞与邻近的细胞分离。根据这一特性，Fladmark等还建立了用MC导致悬浮培养的鲑鱼或大鼠肝细胞解聚的程度来监测毒素的方法，所得结果比用判断细胞凋亡的程度所得结果灵敏5～10倍。
5.4 酶活性抑制检测技术
由于MC等能够抑制PP1和PP2A的活性，因此可以通过对酶活性的抑制程度来监测这几种毒素。自Holmes等提出蛋白磷酸酶抑制检测(protein phosphatase inhibition assay, PPIA)技术以来，这种技术得到了迅速发展。PPIA多数以32P标记的糖原磷酸化酶a为底物。由于糖原磷酸化酶a只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MC等抑制，因此在MC、PP和糖原磷酸化酶反应后根据PP水解糖原磷酸化酶a释放出32P的量就可计算出毒素的量。一般用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线，用MC-LR的量来代表总毒素的量。随着对硝基苯酚磷酸酯(pNPP)可被PP水解现象的发现，人们建立了一种以pNPP为底物的磷酸酶抑制比色监测技术，根据pNPP被水解后产生的有色产物的多少来确定毒素的量。PPIA的监测限度为pg级，它监测的是能抑制PP的总毒素的量，而不是某一种毒素的量。但蓝藻本身具有的内源蛋白磷酸酶活性有可能使PPIA的结果偏低。
5.5 免疫检测
毒素的免疫监测技术的原理是利用毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行监测。
最早的免疫检测是免疫化学技术中最有效的一种分析方法，1960年由Yalow和Berson开创的，用于检测血液中的胰岛素。从此，免疫检测广泛应用于医药化学分析领域，检测激素、药品、病毒等。免疫检测操作非常简单，但是在环境污染物检测分析中的实际应用却非常少。
免疫检测的基础是抗原抗体之间的反应。它是以一种抗体或多种抗体作为分析试剂，对待测物进行定量或定性分析的检测方法。抗体是一种免疫球蛋白，它是动物机体对外来物质（抗原）发生反应而产生的。抗体可以和抗原物质形成抗原-抗体复合物。在免疫化学分析方法中，未反应的抗原和抗体被称作自由相，抗原-抗体复合物被称作结合相。抗原和抗体之间的反应具有特异性，并且非常灵敏。这些特性对于动物机体防御疾病和免疫检测都非常重要。随着样品检测费用的不断提高和检测项目的不断增加，发展了免疫化学检测方法；另一方面，对快速、简单的原位检测的需求，也促进了免疫检测的发展。免疫检测可以广泛地用于检测许多不同的化合物。
自80年代开始，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)开始用于MC的监测。水质免疫检测中最常用的检测方法是竞争性非匀相酶联免疫检测。在这个检测方法通常将抗体包被在96孔板（聚苯乙烯微量滴定板）的微孔底部，或者其他固定相上。把酶标记在已知浓度半抗原上，以便产生可以检测的信号。在待测半抗原和已知浓度的酶标记和抗体形成复合物之后，将剩余的试剂洗脱，加入酶的底物，产生显色反应。根据颜色的深浅，定量抗原，或者根据是否显色，判别样品中是否有分析物存在。

Chu等人首先提出了应用ELISA监测MC的完整程序，他们将MC-LR与牛血清蛋白偶联，用得到的偶联物免疫兔制备兔抗MC-LR多克隆抗体(PAb)，然后将MC-LR与辣根过氧化物酶偶联，以邻苯二胺(OPD)为底物用直接竞争法做ELISA。用不同浓度的标准毒素MC-LR作标准曲线，根据底物的显色程度与标准曲线作比较即可求出毒素的含量，监测限度为0.20μg/L。他们发现抗MC-LR PAb与MC-LR，-RR，-YR有较好的交叉反应性，但与MC-LY，-LA的交叉反应性低。An和Carmichael证实了Chu等的观点，并提出C-6上为E-型的Adda和Arg对毒素的抗原性是必需的。McDermott等用从鸡蛋黄中提取的抗MC-LR PAb做ELISA监测毒素，发现监测限度为95ng/L。这种方法制备的抗体产量大，方法简便，而且对MC-LR和-RR有良好的交叉反应性。尽管抗MC的单克隆抗体(MAb)很早就已制备，但直到1995年才由Nagata等建立起一整套完整的ELISA监测技术，其监测限度为25ng/L。最近，他们又制备了能够特异性的识别抗MC-MAb和MC形成的免疫复合体(immune complex)但不与MC或抗MC MAb反应的单克隆抗体，并建立了一种三明治监测技术，监测限度为2ng/L。目前已有针对MC的ELISA试剂盒可以买到，这大大方便了毒素的监测工作。但目前的试验表明抗体往往只是针对某一种毒素建立起来的，对某些毒素的交叉反应性低，不能监测所有的毒素。有研究表明，将分别针对某一种毒素做ELISA所得结果加起来后与用小鼠法所得结果有很好的一致性。
酶联免疫法由于具有灵敏、快速、简单、便携、易用、适用现场分析等特点，显示出良好的发展趋势。
常规的理化检测仪器，特别是液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪器体积庞大、价格昂贵、需要环境条件较高的室内环境、而且还需要专门的技术人员操作，因此检测费用居高不下（＄40-200/样品）；磷酸酶抑制试验和细胞试验虽然都能很好地检测出毒素，但是灵敏度太低，甚至不能有效地检测出WHO推荐的1mg/L；同时，环境监测的项目、样品数量不断增多，检测限不断提高。免疫分析是基于抗原-抗体特异性反应的分析方法，检测灵敏度高、特异性强、分析容量大、反应速度快、检测费用低廉（＄5-10/样品）。因此，免疫分析技术受到了各国的重视。美国、德国在80年代末开始研究免疫检测方法，世界粮农组织（FAO）已经相许多国家推荐这项技术。因而开发和利用免疫检测技术是有前景的，美国国家环保局（EPA）目前推行的几种用于检测环境中microcystins的方法按先后顺序依次为：
• Immunoassay
• Bioassay
• Protein phosphatase assay
• HPLC
• LC/MS

由于微量蓝藻毒素对人类危害严重，迫切需要对水体中特别是做为饮水水源的湖泊、河流和水库中的蓝藻毒素进行连续监测。上面提到的监测技术是针对分布广、毒性大的微囊藻毒素建立的，这些监测技术各有其优点和缺点，对比如表2所示。
表2　微囊藻毒素监测技术的优缺点
监测技术1) 优点 缺点
小鼠法 毒素的有害效应易检测到 不能区分微囊藻毒素的异构体
操作简单 工作量大；伦理问题
HPLC 对不同毒素可进行定性和定量 毒素需预处理；灵敏度较低
设备庞大、昂贵；需专业人员
ELISA 可检测到毒素的不同同系物 对多种同系物的识别需要广谱抗体；商品化的试剂盒可靠性需进一步检验；标准不统一
商品试剂盒的出现大大方便了操作
高灵敏度
PPIA(放射标记或显色) 只监测PP1和PP2A的抑制剂 测定毒素总量，不能区分特异的毒素同系物
高灵敏度 需要新制备的放射性底物；放射性废物的处理困难
细胞毒性监测 用原代肝细胞可获得高灵敏度 原代肝细胞的生产工作量大
用建立的细胞系可方便实验 建立的细胞系往往灵敏度较低
1)HPLC：高效液相色谱；ELASE：酶联免疫吸附测定；PPIA：蛋白磷酸酶抑制测定；PP：蛋白磷酸酶。