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主题：【求助】关于饲料氨基酸分析样品前处理方法的困惑

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vetgaowei

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发表于：2012/08/12 12:49:38 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

按GB/T 18246-2000叙述：
7.1.1.1 常规水解法：称取含蛋白7.5-25mg的试样于20mL安培中，加10.00ml酸解剂，置液氮或干冰中冷冻，然后，抽真空至7Pa后封口。将水解管放在110度恒温干燥箱中，水解22-24h。冷却，混匀，开管，过滤，用移液管吸取适量的滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中，60C抽真空，蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1-2次。加入3-5ml Ph2.2稀释上机用柠檬酸钠缓冲液，使样液中氨基酸浓度达50-250nmol/ml，摇匀，过滤或离心，取上清液上机测定。
困惑1：文中的安培与水解管是指同一个东西？对吧，一般的医疗器械公司或仪器设备公司是否可以买到？规格为20mL吗？
困惑2：冷冻一定要用液氮或干冰吗？我放冰柜里冷冻不行？对温度有什么要求吗？既然是国标，就应该讲清楚。
困惑3：抽真空是必需的吗？如果没此条件，我充氮气不行吗？无非是要求把氧气赶走，避免氧化反应
困惑4：过滤步骤，却没有说用什么方法过滤？一般的滤纸过滤可以吗？水解液中的氨基酸损失了怎么办？离心可能比过滤好点？
困惑5：我的实验室不具备这些前处理设备，有没有较为简单可行的前处理办法？但前提是不降低测定的准确性和精确性
困惑6：微波水解处理效果如何？哪种牌子和型号？大概价格？
期待大侠给以解答，不甚感激！

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2012/8/13 11:43:36 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1：文中的安培与水解管指的是同一个东西。这个可选用耐压的螺纹玻璃管，也可定做硬质玻璃管，采用酒精喷灯封管。
2：如果没有液氮或干冰，可采用市售食盐+冰按1：3的比例混合。
3：如果不抽真空，有可能会导致爆管。因为在水解过程中，高温下可能会发生一些化学反应，产生气体，使密闭的水解管承受不了较大的压力而爆裂。
4：按照正确的方法，用滤纸过滤即可。
5：所用到的前处理设备都是实验室常用的，部分试剂即使没有也应该很快就可采购到。
6：这个前处理只是水解，微波的温度较高，很难控制，可能会对水解过程产生影响，所以不建议用微波方法。

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2012/8/13 12:19:52 Last edit by wangboxzzjs

vetgaowei

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2012/8/13 12:44:46 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

谢谢了。但还是有疑问：
1. 有人说用聚丙烯的冻存管，带盖，可以吗？
2. 用充氮气的方法代替冷冻抽真空行吗？
3. 过滤步骤中，标准中只说“冷却，混匀，开管，过滤，用移液管吸取适量的滤液，”，那肯定有氨基酸损失的，如吸附在滤纸上。除非这个量忽略不计。比如我们定氮的时候，消化管的液体也要过滤到容量瓶里，但要反复冲洗，然后定容到100mL。这个标准中只说过滤，似乎讲的太模糊了。比如是用定性还是定量滤纸呢？反正我是第一次看到这个标准，读完觉得不知道怎么做。可能写标准的人太熟悉了，他们根本没意识到别人不清楚的东西。

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vetgaowei

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2012/8/13 17:51:03 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

越发糊涂了！
1、今天认真学习了AOAC 994.12 Amino acids in feeds的方法，简直难以相信，人家的东西写得那么清楚，同样是配柠檬酸三钠溶液，人家的清楚注明是称取19.60g tri-sodium citrate dihydrate，而我们的国标也是19.6g，柠檬酸三钠，但没写带不带结晶水（常规水解法中4.1.1.3）。硫二甘醇5.0ml，多大浓度的没说，而AOAC清楚写明98%10ml。或许还有更多未写清楚的地方呢。
2、就过滤而言，AOAC清楚写明用sintered glass filter(本人译为垂溶玻璃砂芯滤器)过滤，而我们的只有“过滤”二字，精辟的很！
3、AOAC使用的是内标法，我们的国标是外标法，还需要再学习一下两种方法的优缺点，等以后再说。
4、就水解处理而言，AOAC采用的是回流水解法，欧盟也是，而我们的标准用真空封管水解法，并且在标准的前言中特别说明“本标准达到了与AOAC等方法同样的准确度和精密度”，呜呼！又是抽真空，又是冷冻，又是封管，忙活了大半天，最后结果是“达到同样的准确度和精密度”，你们这些专家们是真好样的！人家的方法比我们的简单许多，利用我们消化蛋白质定氮的消化管、消解炉外加一个冷却回流装置即可实现。
5、如果发表SCI论文，我该在文章中注明是按AOAC还是GB/T 18246-2000？
6、本人不是在此要崇洋媚外，而是实在是感慨的很！因为我第一次接触这一领域的问题，若不是最近实验的需要我可能还不会去看国标和AOAC的相关内容。算是抛出个臭砖头吧，希望同行们都来关注这个问题！此乃本意！

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ld321

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2012/8/23 10:00:05 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

实验嘛，想知道，简单的两种方法都做一下，然后一对比不就知道了。

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小念

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2014/6/16 23:28:10 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 vetgaowei(vetgaowei) 发表:
越发糊涂了！
1、今天认真学习了AOAC 994.12 Amino acids in feeds的方法，简直难以相信，人家的东西写得那么清楚，同样是配柠檬酸三钠溶液，人家的清楚注明是称取19.60g tri-sodium citrate dihydrate，而我们的国标也是19.6g，柠檬酸三钠，但没写带不带结晶水（常规水解法中4.1.1.3）。硫二甘醇5.0ml，多大浓度的没说，而AOAC清楚写明98%10ml。或许还有更多未写清楚的地方呢。
2、就过滤而言，AOAC清楚写明用sintered glass filter(本人译为垂溶玻璃砂芯滤器)过滤，而我们的只有“过滤”二字，精辟的很！
3、AOAC使用的是内标法，我们的国标是外标法，还需要再学习一下两种方法的优缺点，等以后再说。
4、就水解处理而言，AOAC采用的是回流水解法，欧盟也是，而我们的标准用真空封管水解法，并且在标准的前言中特别说明“本标准达到了与AOAC等方法同样的准确度和精密度”，呜呼！又是抽真空，又是冷冻，又是封管，忙活了大半天，最后结果是“达到同样的准确度和精密度”，你们这些专家们是真好样的！人家的方法比我们的简单许多，利用我们消化蛋白质定氮的消化管、消解炉外加一个冷却回流装置即可实现。
5、如果发表SCI论文，我该在文章中注明是按AOAC还是GB/T 18246-2000？
6、本人不是在此要崇洋媚外，而是实在是感慨的很！因为我第一次接触这一领域的问题，若不是最近实验的需要我可能还不会去看国标和AOAC的相关内容。算是抛出个臭砖头吧，希望同行们都来关注这个问题！此乃本意！

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