细胞传代培养(消化法)
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1.无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于–20 ℃,使用前放在37 ℃ 水槽回温。
3.新鲜培养基
4.无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
(1)传代前准备:
1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。
(2)胰蛋白酶消化;
1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。
2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。
(3)吹打分散细胞:
1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。
4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。