有关物质检查方法验证概要
项目 | 验证结果 |
流动相选择 | 流动相A为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0),流动相B为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液(用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.0)-乙腈(20:80)。 |
专属性 | 各破坏条件下,产生的杂质与主成分能够有效分离,主成分峰未检出不纯物。 |
线性和范围 | 无相关研究内容。 |
定量限、检测限 | 阿莫西林以17.9分钟±1分钟基线计算信噪比,当S/N≒3时,检测限为1.48ng(浓度为0.074µg/ml),当S/N≒10时,定量限为4.92ng(浓度为0.246µg/ml);克拉维酸以6.3分钟±1分钟基线计算信噪比,当S/N≒3时,检测限为1.27ng(浓度为0.063µg/ml),当S/N≒10时,定量限为4.22ng(浓度为0.211µg/ml)。 |
准确度 | 无相关研究内容。 |
精密度 | 自身对照溶液连续进样6次,阿莫西林和克拉维酸峰面积和保留时间精密度RSD均小于0.5% |
溶液稳定性 | 本品供试品溶液室温放置8小时稳定性较好,阿莫西林和克拉维酸钾主峰面积的RSD值和归一化含量RSD值均小于2.0%;当室温放置8小时后,杂质个数和杂质含量没有明显变化。 |
耐用性 | 磷酸盐pH值在5.5~6.0,检测波长230±2nm,流速、柱温耐用范围较宽。 |
梯度洗脱方式(一)
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
tR + 0 | 98 | 2 |
tR + 20 | 70 | 30 |
tR + 22 | 98 | 2 |
tR + 32 | 98 | 2 |
梯度洗脱方式(二)
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0 | 95 | 5 |
0.5 | 95 | 5 |
30.5 | 59 | 41 |
32 | 95 | 5 |
40 | 95 | 5 |
流动相选择试验结果
编号 | 项目 | 保留时间 (min) | 拖尾因子 | 前/后峰 分离度 | 理论板数 | 备注 |
1. | 克拉维酸 | 5.689 | 3.226 | 10.491/3.976 | 2197 | 梯度洗脱方式(一) |
阿莫西林 | 17.390 | 2.180 | 18.500/28.278 | 8089 | ||
2. | 克拉维酸 | 3.991 | 2.278 | 8.434/2.113 | 2999 | 梯度洗脱方式(二) |
阿莫西林 | 7.108 | 0.619 | 12.071/15.620 | 15981 | ||
3. | 克拉维酸 | 5.896 | 2.324 | 1.893/4.169 | 4539 | 梯度洗脱方式(一),阿莫西林克拉维酸钾系统适用性溶液 |
阿莫西林 | 17.715 | 1.116 | 9.157/9.559 | 12318 |
梯度洗脱方式(一)试验结果表
峰# | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积% | 分离度 | 拖尾因子 | 理论塔板# |
1 | 2.486 | 60786 | 13028 | 0.1674 | -- | 1.257 | 6323.810 |
2 | 5.689 | 4837765 | 287075 | 13.3259 | 10.491 | 3.226 | 2197.460 |
3 | 7.287 | 43611 | 3637 | 0.1201 | 3.976 | 0.995 | 8359.856 |
4 | 17.390 | 31074044 | 1075377 | 85.5951 | 18.500 | 2.180 | 8089.375 |
5 | 30.823 | 72372 | 10926 | 0.1994 | 28.278 | 1.057 | 487118.919 |
6 | 32.892 | 17985 | 2492 | 0.0495 | 12.225 | 2.153 | 660669.684 |
7 | 34.688 | 13444 | 1603 | 0.0370 | 10.194 | 1.387 | 530955.536 |
8 | 35.201 | 25749 | 3158 | 0.0709 | 2.508 | 0.980 | 415064.916 |
9 | 35.465 | 82474 | 13215 | 0.2272 | 1.375 | 1.066 | 729717.857 |
10 | 36.992 | 28985 | 4531 | 0.0798 | 9.101 | 1.083 | 761338.657 |
11 | 37.210 | 14670 | 1945 | 0.0404 | 1.123 | 1.514 | 464803.126 |
12 | 37.631 | 13522 | 1910 | 0.0372 | 2.147 | 1.533 | 755129.394 |
13 | 38.218 | 18108 | 2467 | 0.0499 | 3.273 | 1.213 | 678294.893 |
2.梯度洗脱方式(二)色谱图
梯度洗脱方式(二)试验结果表
峰# | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积% | 分离度 | 拖尾因子 | 理论塔板# |
1 | 2.396 | 70204 | 14052 | 0.2263 | -- | 1.260 | 5356.764 |
2 | 3.536 | 22213 | 4102 | 0.0716 | 8.434 | 1.490 | 10282.721 |
3 | 3.991 | 4722251 | 454222 | 15.2221 | 2.113 | 2.278 | 2999.439 |
4 | 7.108 | 25843956 | 1998396 | 83.3078 | 12.071 | 0.619 | 15981.306 |
5 | 10.314 | 93623 | 13114 | 0.3018 | 15.620 | 1.126 | 49414.703 |
6 | 11.438 | 14464 | 1640 | 0.0466 | 5.789 | 1.682 | 51084.560 |
7 | 12.295 | 22616 | 2732 | 0.0729 | 4.217 | 1.198 | 58013.073 |
8 | 12.846 | 13826 | 1975 | 0.0446 | 2.901 | 1.258 | 85431.287 |
9 | 14.665 | 10119 | 1409 | 0.0326 | 9.935 | 1.290 | 95028.741 |
10 | 14.961 | 90552 | 13302 | 0.2919 | 1.597 | 1.025 | 108581.287 |
11 | 16.729 | 33026 | 4621 | 0.1065 | 9.589 | 1.175 | 128089.462 |
12 | 16.978 | 19693 | 3281 | 0.0635 | 1.422 | 1.182 | 172732.652 |
13 | 17.508 | 12467 | 1918 | 0.0402 | 3.157 | 1.163 | 164978.729 |
14 | 25.930 | 29720 | 3068 | 0.0958 | 39.812 | 1.301 | 171190.507 |
15 | 29.724 | 13496 | 1058 | 0.0435 | 14.033 | 1.375 | 168014.637 |
16 | 32.588 | 10033 | 1313 | 0.0323 | 11.558 | 1.040 | 402421.620 |
3.梯度洗脱方式(一)阿莫西林克拉维酸钾系统适用性对照品色谱图
梯度洗脱方式(一)阿莫西林克拉维酸钾系统适用性对照品试验结果表
峰# | 保留时间 | 面积 | 高度 | 面积% | 分离度 | 拖尾因子 | 理论塔板# |
1 | 2.964 | 21439 | 2579 | 0.1508 | -- | 1.094 | 3395.986 |
2 | 5.371 | 389797 | 50045 | 2.7426 | 11.799 | 1.087 | 11026.214 |
3 | 5.896 | 2107428 | 170019 | 14.8278 | 1.893 | 2.324 | 4539.717 |
4 | 7.255 | 1510237 | 133174 | 10.6260 | 4.169 | 1.328 | 9235.805 |
5 | 13.108 | 10481 | 772 | 0.0737 | 17.475 | 1.139 | 20319.676 |
6 | 17.715 | 3912953 | 160110 | 27.5314 | 9.157 | 1.116 | 12318.531 |
7 | 24.277 | 26440 | 989 | 0.1860 | 9.559 | 1.044 | 17478.699 |
8 | 26.380 | 59371 | 3686 | 0.4177 | 3.619 | 0.955 | 60813.166 |
9 | 27.993 | 915721 | 105879 | 6.4430 | 4.966 | 1.105 | 255506.176 |
10 | 28.349 | 28333 | 2740 | 0.1994 | 0.523 | - | 9899.258 |
11 | 28.676 | 113138 | 13057 | 0.7960 | 0.468 | - | 196688.306 |
12 | 28.921 | 320742 | 18451 | 2.2567 | 0.757 | - | 88122.596 |
13 | 29.385 | 201574 | 19724 | 1.4183 | 1.498 | - | 262227.283 |
14 | 29.975 | 72838 | 3511 | 0.5125 | 1.444 | 1.572 | 41664.543 |
15 | 30.926 | 20615 | 2554 | 0.1450 | 2.477 | 2.128 | 468652.257 |
16 | 31.622 | 32844 | 1973 | 0.2311 | 2.170 | 0.865 | 75230.319 |
17 | 32.105 | 176405 | 28939 | 1.2412 | 1.550 | 0.973 | 631905.752 |
18 | 32.356 | 366618 | 59054 | 2.5795 | 1.542 | 1.193 | 625701.788 |
19 | 32.701 | 40439 | 7137 | 0.2845 | 2.216 | 0.894 | 778326.980 |
20 | 33.282 | 1887682 | 246247 | 13.2817 | 3.264 | 1.440 | 412080.833 |
21 | 34.193 | 12202 | 1879 | 0.0859 | 5.332 | 0.708 | 1034079.814 |
22 | 34.509 | 447826 | 44332 | 3.1509 | 1.790 | - | 399649.798 |
23 | 34.740 | 45865 | 6248 | 0.3227 | 0.990 | - | 314086.523 |
24 | 35.100 | 21272 | 3377 | 0.1497 | 1.713 | 1.041 | 666685.150 |
25 | 35.362 | 1121816 | 174619 | 7.8931 | 1.532 | 1.151 | 691473.561 |
26 | 35.925 | 38560 | 5102 | 0.2713 | 3.357 | 1.598 | 754056.359 |
27 | 36.526 | 10241 | 1775 | 0.0721 | 3.725 | 0.892 | 864169.567 |
28 | 36.720 | 10145 | 2109 | 0.0714 | 1.356 | 0.851 | 1289084.363 |
29 | 36.930 | 151940 | 24732 | 1.0690 | 1.430 | 0.946 | 808191.334 |
30 | 37.128 | 51837 | 9398 | 0.3647 | 1.260 | 1.176 | 973129.284 |
31 | 37.605 | 52427 | 4153 | 0.3689 | 1.837 | 0.747 | 166983.281 |
32 | 38.129 | 22784 | 3711 | 0.1603 | 1.955 | 1.029 | 821709.654 |
33 | 38.920 | 10662 | 1791 | 0.0750 | 4.825 | 0.987 | 949702.610 |
阿莫西林和克拉维酸检测限的确定
序号 | 峰高(mAV) εmax | 峰高(mAV) εmin | 峰高(mAV) Δε | 平均峰高(mAV) Δε | 检测限(mAV) |
1 | 0.0375 | 0.0025 | 0.035 | 0.035 | 0.105 |
阿莫西林检测限验证浓度
序号 | 浓度(µg/ml) | 峰高(mAV) εmax | 峰高(mAV) εmin | 峰高(mAV) | 信噪比 |
1 | 40.966 | 41.630 | 0.095 | 41.535 | 1186.7 |
2 | 4.097 | 3.768 | -0.0425 | 3.810 | 108.8 |
3 | 0.819 | 0.812 | 0.0065 | 0.805 | 23.0 |
4 | 0.246 | 0.225 | -0.013 | 0.238 | 6.8 |
5 | 0.074 | 0.195 | 0.120 | 0.075 | 2.1 |
克拉维酸检测限验证浓度
序号 | 浓度(µg/ml) | 峰高(mAV) εmax | 峰高(mAV) εmin | 峰高(mAV) | 信噪比 |
1 | 10.538 | 21.888 | 0.0125 | 21.876 | 625.0 |
2 | 1.054 | 2.038 | -0.0135 | 2.0515 | 58.6 |
3 | 0.211 | 0.4078 | -0.025 | 0.4328 | 12.4 |
4 | 0.063 | 0.142 | -0.0025 | 0.1445 | 4.1 |
2%自身对照溶液精密度试验结果
项目 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 平均值 | RSD |
阿莫西林峰面积 | 618694 | 617266 | 615735 | 615642 | 616373 | 616498 | 616701 | 0.2% |
阿莫西林保留时间 | 17.810 | 17.803 | 17.811 | 17.790 | 17.808 | 17.819 | 17.807 | 0.1% |
克拉维酸峰面积 | 98895 | 98469 | 98142 | 98184 | 98568 | 98754 | 98502 | 0.3% |
克拉维酸保留时间 | 6.116 | 6.109 | 6.129 | 6.118 | 6.115 | 6.117 | 6.117 | 0.1% |
溶液中的阿莫西林稳定性试验结果
时间(h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 平均值 | RSD |
阿莫西林峰面积 | 30724639 | 30673074 | 30671435 | 30624787 | 30579965 | 30654780 | 0.18% |
归一化含量(%) | 86.232 | 86.101 | 86.117 | 86.110 | 85.583 | 86.029 | 0.30% |
溶液中的克拉维酸钾稳定性试验结果
时间(h) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 平均值 | RSD |
克拉维酸钾峰面积 | 4513046 | 4505865 | 4502275 | 4489002 | 4475272 | 4497092 | 0.33% |
归一化含量(%) | 12.666 | 12.648 | 12.641 | 12.622 | 12.525 | 12.620 | 0.44% |
时间(分钟) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
tR + 0 | 98 | 2 |
tR + 20 | 70 | 30 |
tR + 22 | 98 | 2 |
tR + 32 | 98 | 2 |
耐用性研究项目 | 试验方法的条件 | 确认的耐用性范围 |
流速(活性成分的保留时间变化) | 0.8~1.2ml/min | 1.0±0.2ml/min |
色谱柱温度 | 室温 | 20℃~30℃ |
缓冲盐pH值变化 | pH值5.5~6.5 | pH值5.5~6.0 |
检测波长 | 220nm~240nm | 230±2nm |
试验结果色谱图(1.0±0.2ml/min)(色谱图见附件214~218)
耐用性研究项目 | 试验方法的条件 | 确认的耐用性范围 |
流速(活性成分的保留时间变化) | 0.8~1.2ml/min | 1.0±0.2ml/min |
色谱柱温度 | 室温 | 20℃~30℃ |
缓冲盐pH值变化 | pH值5.5~6.5 | pH值5.5~6.0 |
检测波长 | 220nm~240nm | 230±2nm |
试验结果色谱图(1.0±0.2ml/min)(色谱图见附件214~218)
流速变化试验结果
流速(ml/min) | 两成分主峰分离度 | 主峰面积比 |
0.8 | 11.213/11.723 | 11.993/86.238 |
1.0 | 11.064/11.215 | 11.996/86.415 |
1.2 | 10.260/9.651 | 11.899/86.290 |
柱温变化试验结果色谱图(色谱图见附件214、219~222)
柱温变化试验结果
柱温(℃) | 两成分主峰分离度 | 主峰面积比 |
20 | 11.636/24.132 | 10.289/87.937 |
室温 | 11.064/11.215 | 11.996/86.415 |
30 | 1.633/10.550 | 11.855/85.981 |
缓冲盐pH值变化试验结果色谱图(色谱图见附件214、223~226)
缓冲盐pH值变化试验结果
缓冲盐pH值 | 两组份主峰分离度 | 主峰面积比 |
5.5 | 11.148/8.286 | 11.728/86.731 |
6.0 | 11.064/11.215 | 11.996/86.415 |
6.5 | 12.096/28.697 | 11.460/86.309 |
检测波长变化试验结果色谱图(色谱图见附件214、227~230)
检测波长变化试验结果
检测波长(nm) | 两组份主峰分离度 | 主峰面积比 |
220 | 11.625/9.596 | 18.290/79.450 |
230 | 11.064/11.215 | 11.996/86.415 |
240 | 11.687/15.825 | 5.207/92.969 |