主题：【分享】高压气体基因枪的标准操作程序（SOP）

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发表于：2013/05/12 11:39:36 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

关键词：Gj-1000高压气体基因枪
目的：Gj-1000高压气体基因枪的正确使用

酵母基因枪转化
一钨粉的制备
1. 60mg（w）放在离心管中加入无水乙醇，用超声波粉碎机至手感温度发烫；
2. 1000r/min离心10s，去掉上清液；
3. 加1ml无水乙醇，漩涡振荡3~5分钟；
4. 静止1分钟；
5. 1000r/min离心10s，去掉上清液；
6. 加1ml消毒蒸馏水，旋涡振荡，离心沉淀，弃掉上清液；
7. 重复（6）三次；
8. 在沉淀的金粉或钨粉中加入50%甘油，浓度为60mg（钨粉）/ml。
二 DNA子弹的制作
1. 振荡50%甘油中的钨粉，使之成为悬浮液；
2. 取50μl的悬浮液于离心管中（此管可以打6枪，根据实验样品的多少与分成几个小管）；
3. 取一个小管在液体上的壁处用加样器加入5~10μl的质粒DNA（浓度为1μg/μl），振荡30s，再在小管壁上加入20μl亚精胺（0.1M），振荡30s。边振荡便加入50μlCaCl2溶液（2.5M），漩涡振荡30s~1min，之后静置1min，重复（漩涡振荡30s~1min，之后静置1min）5次左右，冰上静止30min，15000r/min离心10s,弃掉上清液；
4. 加入150μl70%的乙醇，吹打一下沉淀，若沉淀均匀散开，则离心（3000r/min 10s），弃掉上清液，加入无水乙醇，进入第（5）步操作。若吹打不散，则用超声波振散，条件为，加70%的乙醇600μl，功率200W，超声波作用1s，4~6次，然后离心，弃掉上清液；
5. 加入250μl无水乙醇，不破坏沉淀，静置1min，离心（1000r/min 10s）弃掉上清液；
6. 加入大于60μl无水乙醇振荡使成为悬浮液，如悬浮良好，可将此悬浮液用加样器取10μl分别滴在钢膜上，共可加样在6片钢膜上。这样平均每片钢膜为：0.5mg钨粉，0.8μgDNA（以5μl质粒DNA计，质粒多一些效果会好一点）。
三实验前的准备
1. 75%的已醇对枪室，样品圆筒室及气体加速管包括封口螺母进行消毒灭菌；
2. 将可破裂圆膜在100%乙醇中浸泡15min消毒，然后再无菌条件下干燥：钢膜则在121℃高温消毒20min后烘干（也可用75%乙醇消毒）；
3. 清洁高压管道，在新装基因枪或重新移动位置时，连接高压气体钢瓶与压力调节阀、表系统的的高压管道的一端接口，另一端先不与基因枪的接口相连，握住此端朝向地面，使钢瓶放气（小流量）冲洗此管1~2s，再连接到基因枪上；
4. 消毒操作工具。
四操作步骤
1. 打开气体瓶阀，调节压力使发射压力达到试验工作要求的范围；
2. 开动真空泵；
3. 选择所需压力的爆破膜（100MP），将它放在钢膜螺母的内圆孔的台肩上，将钢膜螺母旋在储气仓螺口上，用球形扳手将螺母旋紧，确保不漏气；
4. 将涂有DNA微粒的钢膜的放在钢膜架上，等干后用镊子夹起放在弹膜架的圆孔中（带有微粒的一面朝下），旋紧钢膜封口螺母；
5. 用镊子将涂有待转化酵母的YPD平板放入基因枪样品架上，此样品架可在样品室内选择合适的位置（4.5cm）；
6. 将已装上DNA的弹膜座装在已装好样品的样品室，安装方法：将手柄往下移并旋转至卡住，这样发射腔筒下平面与升降座上平面之间扩大了空间，可将将样品室与弹膜座放在升降底座上，当手柄放开后，样品室上升，是三件体结合在一起，件与件之间都有密封圈密封；
7. 按下真空开关，真空泵开始工作，真空表指示针指示真空下降，当真空度达到0.085~0095Mpa时，即可按高压触发按钮向储气仓内充气，（若真空抽不上，可能三件体没有合上，可移动一下三件体），同时观察高压气体监测表的的压力值。在达到爆破膜的爆破压力时，瞬间产生一个气体冲击波轰击钢膜，同时钢膜表面的微弹（包覆DNA微粒）通过垫网继续高速飞行射入靶细胞；
8. 关闭真空按钮，按下真空释放钮，使系统卸荷并将样品取出。这样一次基因导入试验完毕；
9. 按下手柄，取出样品室与弹膜座，从样品室的样品皿座上取出样品皿，盖上盖子，编号记录实验内容及条件；
10. 从弹膜座圆孔穴中取出钢膜，接着拧下封口螺母，从圆孔台肩上取出已穿孔的爆破膜；
11. 从步骤3开始重复操作，完成所有的样品处理；
12. 关机：枪用完后应关闭氦气瓶阀，并在真空泵仍处在工作状态，按下高压触发开关是氦气压解除。关闭电源总开关。从插座上拔下电源线插头；
13. 实验完毕后进行整理清洁工作。一般用75%的乙醇清洗[9]。

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