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主题：【讨论】柱压和流动相的关系？

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发表于：2013/10/04 11:12:55 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
仪器：安捷伦1100

柱子：superdex 200 预装柱（玻璃管）（压力上限：15bar）

流动相：0.05MPBS 或 4M尿素

流速：0.5ml/min

样品：10-20万的蛋白质

事件描述：最初用PBS做流动相，压力在8bar，跑样品是为10bar。做了一周样品（每次做完都会按要求用水冲洗）后，发现压力有所上升，分别是10bar和12bar。于是用清洗剂清洗。用100%甲醇（说明书上说可以用）洗后，用尿素作为流动相，再跑样时压力开始增加。用尿素平衡时，压力是缓缓上升的，直到超出设定的最大压力（25bar）泵停止运行。

分析原因发现确定是柱子堵住了。认为是样品析出堵住了柱子。于是用酸、碱交替冲洗。调节流速在0.1ml/min。两天下来压力从11bar降到3bar不变。本以为柱子冲干净了，可再用尿素做流动相时压力还是升高，而且紫外显示依然有蛋白洗出。没办法，用0.25mg/ml的糜蛋白酶（将样品水解掉）又洗了一夜，发现压力又升高到泵停止运行。再用酸碱洗，压力下降到3bar（0.1ml/min）。

问题：在一定流速下，为什么不同的流动相冲洗时压力不同？(粘度是影响因素之一，4M尿素很粘。但这解释不了糜蛋白酶压力升高的问题啊)。好急人啊！！
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小不董
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2013/10/8 16:57:59 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
蛋白真的很讨厌，很不好做，一个容易变性，还容易吸附，吸附了不好洗脱。
4M尿素是不是盐太高了，就用0.05的PBS是否就好些？用后及时用纯水冲洗干净。
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2013/10/9 10:10:49 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 小不董(doxw0323) 发表:
蛋白真的很讨厌，很不好做，一个容易变性，还容易吸附，吸附了不好洗脱。

4M尿素是不是盐太高了，就用0.05的PBS是否就好些？用后及时用纯水冲洗干净。


确实是这样，4M尿素盐太高，现在已经改用0.05PBS了。谢谢！
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