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主题：【分享】在鲜切苹果中香兰素对致病性微生物和腐败微生物以及需氧微生物生长的抑制作用

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发表于：2013/12/31 23:52:39 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

摘要：

香兰素的抑菌效果对四种致病性或指示微生物的抑制作用，包括大肠杆菌、绿脓杆菌、肠杆菌以及沙门氏菌血清无性系种群；血清型和四种有害微生物（包括白色念珠菌、乳酸菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母）等可能与新鲜苹果生产过程中的污染有关，这一点已经被检验。香兰素的最小抑菌浓度(MIC)取决于微生物的种类，这个范围往往介于6到18mM之间。当加入到一个抗氧化特性浸渍溶液中（钙抗坏血酸盐），12mM香兰素对各地新鲜的“帝国”和“Crispin”两种苹果中总需氧量微生物的抑制提高了37%和66%。苹果的贮藏过程为4 °C 条件下19天。12mM香兰素并没有影响到自然密封过程中对酶促褐变和软化的控制。这些研究结果为香兰素在冷藏采摘的水果和蔬菜方面作为一个潜在的抗微生物剂提供了新的见解。

关键词:

香兰素; 天然抗菌; 鲜切苹果; 保质期;病原微生物损坏情况。

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2013/12/31 23:55:57 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、介绍：

消费者对于方便和营养的微加工生产的需求正在稳步增加，比如像鲜切苹果的生产方面。通过目前通用的鲜切苹果处理技术像浸渍钙抗坏血酸盐来防止酶促褐变和软化，对于一个苹果片来说保质期至多为21天。然而，鲜切工业的生产正在面临挑战，比如潜在疾病的爆发，这可以与延长这些产品的保质期过程中微生物的生长联系到一起。目前有一种趋势，那就是在鲜切苹果生产工业，人们对于寻找自然抗菌药物的兴趣越来越浓，这些药物在化学性质上与削减浸渍的解决方案是兼容的。

天然抗菌素包含的化合物源自生物材料。有三种天然的抗菌物质，包括：动物酶(溶菌酶,乳过氧化物酶)，其他蛋白(乳铁蛋白和卵铁传递蛋白等);(2)植物的次生代谢物(植物抗毒素,酚和精油);(3)微生物产生的细菌素(乳酸链球菌肽和抗球菌素) 最近,许多植物提取物已被证明对于影响食品质量和安全的很广泛的范围的微生物具有抗菌活性。尽管我们对于如香兰素,苯甲醛,阿魏酸,草蒿脑,愈创木酚和丁香酚等是疏水的并且含有芳香结构类似，有的防腐剂如苯甲酸很早就被人们发现和利用，但我们对于微生物抵抗这些天然抗菌素及化合物的耐药机制目前知之甚少。

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2013/12/31 23:58:51 Last edit by 012304

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2013/12/31 23:56:33 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

香兰素一种主要在植物（香草豆）中发现的化学成分,通常被认为是安全的(GRAS)，并且广泛应用于冰激凌、饮料、饼干、巧克力、糖果、甜点等作为香味化合物。香兰素，出现在香草豆的精油部分，在结构上类似于丁子香酚(2甲氧基-4 -(2丙烯基)苯酚)，是从丁香提取出来的众所周知的抗真菌和细菌的化合物。

香兰素在MTC被发现与其它酚类抗菌素如香芹酚和百里香酚相比具有更强的抑菌作用，得出这些结论的研究所使用的菌类有大肠杆

菌，植物乳酸菌和李斯特菌。香兰素的抑菌活性主要体现在破坏细胞质膜的完整性，这是离子梯度损失,pH值动态平衡丧失和呼吸活动受到抑制的结果。最近，香兰素已经被广泛证明能够在体外以及在果酱和果汁有效地抑制酵母和霉菌。12mM香兰素抑制四种食品腐败微生物的生长，包括：酿酒酵母、Zygosaccharomycesrouxii, Debaryomyces hansenni 和 Zygosaccharomycesbailii，于27 °C条件下在培养皿和苹果泥中储存40天，掺入香兰素 (3-7mM)的水果培养基抑制

四种曲霉菌的增长保存了两个月，当结合2mM的山梨酸甲酯，3mM的香兰素能够抑制增长的三个青霉菌物种: Penicillium digitatum, Penicillium glabrum,和 Penicillium italicum的生长，在马铃薯葡萄糖琼脂(pH值为3.5,水分活度0.98)中保存1个月。最近有一个报道，讲的是接种在104cfu /ml级别的苹果汁和桃子味软饮料的两种酵母菌株（S. cerevisiaeand Candida parapsilosis），分别使用20和10mM浓度的香兰素进行抑制，可以在25°C下进行至少为期8周的储存。因此,对融入香兰素的钙抗坏血酸盐（一种浸渍溶液）的抗菌性能进行研究，可以为延长现摘水果的货架期提供新的机会。本研究的目的在于确定：

1、香兰素作为一种自然抗菌剂对选定的致病性、指示性、腐败性微生物的剂量依赖性效力；2、自然密封条件下，香兰素（12mM）对鲜切的帝国和‘Crispin’两种苹果中全部需氧微生物的抑制效力。

2、材料和方法：

2、1微生物和培养条件

研究中使用所有菌株均来自美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国型培养菌种集（ATCC）的致病性和指示性菌种。包括大肠杆菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)、肠杆菌属 (ATCC 13048)、沙门氏菌血清无性系种群（ATCC血清型6962年)以及四种有害微生物包括:白色念珠菌(ATCC 10231)、s酵母(ATCC 9763)、Penicillum expansum(ATCC 7861),干酪乳杆菌(ATCC 7469)。培养中，两种酵母菌的培养应用麦精肉汤，而胰酶解酪蛋白大豆肉汤应用于剩余菌种作为培养基。

2、2香兰素的制备

需准备不同浓度的香兰素(分别为0、1.5、3、6、12、和18mM)，各种浓度均一式三份，所有香兰素均加到(亚什兰加拿大公司)相应的无菌生长培养基并使用微波炉加热两分钟灭菌。然后分发到10毫升的无菌试管中备用。

2、3药敏试验

我们为每个微生物准备好了培养液，使用浓缩的1￡108 cfu/ml的规格作为标准(最小红斑量诊断学,渥太华,加拿大)，并且准备100升的培养液制作培养基用于接种。微生物生长取决于在600nm的分光光度计中的浊度读数 (巴克斯特诊断公司,美国)。对于超过分光光度计准确测定范围的培养,将相应的培养条件浓度稀释10倍。标准生长曲线有六个数据点是这八种微生物都确定的，和用来确定活细胞OD600外径值。实验所用的香兰素一式三份，并且操作独立重复进行两次。

2、4用香兰素处理鲜切苹果

苹果品种为两种，一是帝国，二是Crispin，是从加拿大运过来的。在成熟的季节，测定其稳定的可溶性固性物指数和淀粉指数（康奈尔大学泛型淀粉染色实验），两种苹果的克里斯宾指数分别为17.6, 11.5,

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2013/12/31 23:57:03 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2.6 和18.1, 12.4, 3.1。

苹果被储存在标准的可控环境中(CA,2.5% O2+2.5% CO2, 0 °C, >95% RH)6-8个月，实验时苹果在室温下2个小时，苹果用一种抗菌溶液水洗，溶液为 100 _l/l 次氯酸钠, pH用柠檬酸调节到6.5同时维持低温在 4–6 °C。将其置于无菌排烟罩中2min，风干10 - 15分钟,然后切成10片薄片并消毒（不锈钢苹果切片机，加拿大)。或者在6%的钙抗坏血酸盐水溶液中(韦斯特波特,CT,美国) 将12mM香兰素冷却到4 - 6°C。或在冷冻(4 - 6°C)的水中3分钟。多余的液体进行排干处理。实验材料使用独立的容器一式三份。从池中100片样品中随机抽取6片并且用聚乙烯袋(氧气传输速率为220cm/m2/24 h12￡17厘米大小)。一袋六片作为一个实验单位。袋装的苹果片在4 °C下每隔天1、5、9、14和19进行检测有氧菌落计数。另一组袋在相同条件下每隔0、4、8、13和18天的间隔对质量进行评估。

2、5总有氧菌落数的计数

两个苹果品种,“帝国”和“Crispin”的总有氧菌落计数(ACC)是25 g的苹果片均质化后在225毫升的0.1%蛋白胨中处理1分钟。并准备10倍系列稀释(1毫升在9毫升0.1%蛋白胨) 并在37°C培养48小时。 PetriWlm萡拥有数从20到200cfu被被认为是在可数范围。

2、6切割面的坚度

每个苹果切片的切割面由一个硬度计与一个5.0毫米直径的测试砧(球)组成的软件系统(德国)进行测定。硬度计的原理是基于渗透原理,其中包括一个水平的弹簧力。这些测量通过按试验贴在切割面苹果片，手动直到声信号指示测量。测量时间是3 s，力的单位是牛顿 (N)。每个苹果片在果皮边界和中心点之间的区域内的三个读数都要记录。

2、7切割面的颜色强度

测定每个苹果片的颜色使用特定的色度计(模型cr - 300;美能达、日本),色度计校准标准白板(YD92.30,xD0.3162,yD0.3323)。坐标是三个读数 L(轻)、a(绿色色度)和b(黄色色度) 。记录每一块在边界和中期点之间的区域内果皮和果肉的读数(两个读数,一边一个进行阅读)。单位时间观测记录了每六片组成的一式三份的样品。减少一个L值表示一个损失的白度=（100-((100寤/font])2+a2+b2)1/2,一个更积极的a值意味着更多色度。积极的b值表示更泛黄。使用上面的三个值计算描述颜色强度。

2、8数据统计

统计分析用SAS系统构造一般线性模型，使用阶乘方差分析进行分离检测，使用图基定法范围测试(t)。

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2013/12/31 23:57:23 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3、结果：
3、1香兰素在体外的抗菌活性
五个浓度(0,1.5, 3, 6, 12, 18mM)的香兰素的剂量依赖性影响八种微生物是通过在培养基对浊度进行评估确定的，微生物的生长显示，随着浓度的升高，生长受到抑制的程度逐渐增加（见表一）。香兰素剂量的作用受到微生物种类的影响。例如，人们观察在四个致病细菌中，6mM的香兰素抑制大肠杆菌增长达到了的73%。同一水平的香兰素对其他三个生物的抑制作用较低 (45%或更少)。同样,在腐败微生物中,91%的增长被3mM水平的香兰素抑制通常,大部分微生物测试研究显示香兰素的浓度与一般位于6-18mM水平，然而，MIC在这项研究的应用表明P.expansum似乎略微超过最高浓度(18mM)。 3、2香兰素对鲜切苹果的抗菌作用
一般来说,未经处理的苹果切片中，在4°C条件下，从第1天到第19天，需氧菌落总数用检测法检测鲜重增重约4.3logcfu / g(见表2)。相比之下,在自然密封状态下用12mM的香兰素处理的样品，苹果片鲜重平均增重只有1.6 logcfu / g 。19天的时间，香兰素的浸渍溶液抑制微生物的总百分比为37%和66%。在现摘的“帝国”和“Crispin的苹果中，溶液抑制微生物的生长显著(P < 0.01)。
在5到19天的贮藏期中，总体上看浸渍溶液对两种苹果都具有抑制作用。但在在5、9和14天的时候单纯封闭储存的“帝国”品种的苹果中微生物的生长也受到抑制，相比于水处理切片，可能是因为它能够在苹果的切割面保留细胞的完整性。
3.3。果肉坚度和切割面褐变
在4°C条件下，封闭储存及浸渍溶液共同作用下，对于能够抑制酶促褐变软化和维持表面硬度以及改善表面白度指数降低这两个主要表面质量属性方面，并没有起到作用(见表3)。

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2013/12/31 23:57:58 Last edit by 012304

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2013/12/31 23:57:38 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4、讨论：
鲜切食品中日益增长的消费需求和潜在的有关食品安全问题使得我们有兴趣对所用的天然抗菌素进行研究，以抑制微生物的生长达到延长货架期的目的。尤其值得一提的是,把苹果片和削减浸渍溶液在自然密封状态下可以保留21天，苹果片基本维持原来的颜色和坚硬度。但同期水平的总微生物负载可能会增加到不可接受程度。
我们尝试使用被认为是有效地安全的自然抗菌素改善这一状况，兼具保藏和抑菌性质的浸渍溶液可以改善鲜切苹果等食品的质量和安全。在自然条件下，有数目巨大的有效抗菌素存在，然而只有有限数量被发现并应用于食品领域。
香兰素,一种低分子量植物酚类分子,是一个具有多个属性的独特的食品添加剂。自然和人工合成的(自然相同)香兰素已广泛应用在食品工业被认为是安全的调味品,它的感官特性很好的被消费者所接受(霍金,1997年,钱德拉2000)。香兰素是一个有效地抗氧化剂，在复合的食物比如干燥的含有不饱和脂肪酸及衍生物的的食物(如谷类)中比未经处理的同类产品具有更好的维持质量的作用。
先前的研究已经证明了抗菌活性的香兰素对酵母和霉菌的抑制作用，虽然报告的香兰素抗菌性能是有限的。本次试验中，我们研究香兰素的抑菌效果对四种致病性或指示微生物的抑制作用，包括大肠杆菌、绿脓杆菌、肠杆菌以及沙门氏菌血清无性系种群；血清型和四种有害微生物（包括白色念珠菌、乳酸菌、干酪乳杆菌和酿酒酵母）等可能与新鲜苹果生产过程中的污染有关。我们都知道,这是对香兰素对产气菌和干酪乳酸菌的抑制作用的首次报告。有趣的是,被检测的微生物，除了p . expansum之外，达到抑制效果的的香兰素浓度都在6-8mM之间， p . expansum的则大于18mM。不同微生物的抑制浓度在6-8mM之间是基于MIC的结果。
例如, 菲茨杰拉德报告的美国啤酒的MIC值是17mM。此外, 有两种菌p.digitatum和p.italicum的香兰素MIC值是6.6毫米，相同条件下，p.glabrum的MIC值是9.6毫米。有趣的是，菲茨杰拉德的实验在1.5和3毫米(MIC)浓度香兰素条件下，对酵母菌抑制提高了。
我们在报告中首次提到，在自然密封状态下用12mM的香兰素处理的样品，苹果片鲜重平均增重只有1.6 logcfu / g 。19天的时间，香兰素的浸渍溶液抑制微生物的总百分比为37%和66%。在现摘的“帝国”和“Crispin的苹果中，溶液抑制微生物的生长显著(P < 0.01)。我们观察“帝国”和“Crispin”苹果片,导致这些效果不同的因素包括:不同表面的PH不同,基本营养水平不同(维生素、矿物质、含氮化合物的)。上述研究是基于体外观察MIC的价值和其他几个因素产生的。先前的研究表明,该条件下香兰素对微生物的作用温度较高，所用为处于孵化温度的微生物培养基,研究该MIC的温度值是30°C和28°C。因此,我们推测处于较低的温度(4°C)条件下，应用香兰素的浸渍溶液对鲜切苹果的抑菌效果会更好。此外,面包店和饮料工业用的香兰素水平介于1.3到12.5mM。
我们的初步观察也表明,香兰素浓度超出12mM，会在鲜切苹果中产生不容易使人接受的滋味和香气，香兰素作为一个兼容的添加剂，在自然密封状态下对苹果的坚硬度和软化程度的转变没有太大的作用。总之,香兰素,作用于含有鲜切苹果片的八个试管中，对微生物总体上能起到抑制作用，其功效与自然密封条件是结合在一起的。因此,本研究提供了一个用香兰素保藏鲜切苹果的新的见解。然而，在正式推荐作为抑菌剂使用之前，香兰素作为自然抗菌剂在鲜切苹果中应用，是否能够在感官品质和消费者接受程度上达到预定的要求，还需要我们进一步研究以便对这些信息做出确定。

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