实验目的：实验背景及目的

我的实验目的是利用高效液相色谱法（HPLC）检测并分离丝状真菌产生的次生代谢产物。丝状真菌俗称霉菌，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，便是霉菌。丝状真菌能够合成结构多样、具有重要药理性和毒理性的天然产物而受到广泛的关注。丝状真菌的代谢产物对人类生活起到了至关重要的影响，它们的巨大应用价值与影响，推动着人们对它不断地研究探索，有些可做药用，比如人类所发现最早的抗生素－青霉素（Penicillin），是由青霉菌（Penicillium）所制造；环孢霉素（Cyclosporin）用于器官移植时抗排异反应；他汀类可用于降血脂预防中风等；有的又具有强毒性，有致癌作用，威胁人类的健康，比如黄曲霉毒素和单端孢霉烯等。在食物的生产方面，一些霉菌也被刻意培殖应用，例如：蓝起司是发酵后再加入青霉菌所制成的；酱油、豆瓣、豆豉和味噌等需要米曲菌发酵；红糟、豆腐乳和红露酒等则是由红曲菌所发酵制造；发酵臭豆腐的臭滷水也含有多种菌种。

目前已知的丝状真菌次级代谢产物只是真菌能够合成的产物的冰山一角，比如分析构巢曲霉(Aspergillusnidulans) 基因组，发现该菌具有产生27 个聚酮类化合物，14 个非核糖体多肽，1 个萜类化合物以及两个吲哚生物碱的潜力，然而目前的培养条件下，仅发现数个次级代谢产物。HPLC技术的发展与应用，为这些重要的真菌次生代谢产物的鉴定与分离提供了可实现的途径，越来越多的重要次生代谢产物被发现，被研究以及应用，人类生活得以改善，生命质量得以提高。并且在研究次生代谢过程的调控机理中涉及一些中间产物的分离与鉴定，促进研究向更为深入的基因分子水平迈进，从而实现某些具有药用价值的次生代谢产物实现大量生产，从而降低医疗成本；有效控制某些毒素在生物体内的积累，减少不必要的损害。

实验方法：前处理、标准品配制、色谱条件等

待测样品的前处理：对所研究的菌株在合适的条件(富含糖类和氨基酸以及少量的无机盐等配制而成的液体培养基，25摄氏度左右200rpm摇瓶培养10天左右）下进行小规模培养（大约0.5L)，待到菌体丰富后，收集菌丝体，蒸馏水洗涤后加入乙醇、乙酸乙酯、甲醇等有机试剂进行一段时间（大约半天）浸泡萃取，将萃取液浓缩后用旋蒸仪蒸干，再用1-2ml甲醇将剩余物洗脱溶解下来，后经过滤去不溶性杂质，经硅胶柱进行初步分离，得到粗分离样品，再经HPLC 进行细分，收集目标峰对应的流出液，即得到较纯的目标产物。

标准品配制：将买到的浓度为25g/ml的标准品稀释125倍后备用。

色谱条件：Athena C18,5μm,120Å柱，柱温60℃，上样量为4μl（可视情况而改变），流动相乙腈与水，流速1ml/min，HPLC分析参数如表所示。

HPLC分析参数

结果分析：色谱图、标准曲线、回收率等

色谱图

标准品标准曲线（纵：峰面积，横：样品浓度μg/ml)

讨论：讨论实验内容及对CNW液相色谱柱的评价

本样品中不同物质能够较好的分离开，并且结果重复性好，峰型也较尖细，能够有效地将每个峰对应的产物分离出来，总之CNW液相色谱柱使用效果较好。

另外有个小的建议，本柱子柱温上限为60℃，如果能改善一下提高柱温上限就更好了，因为某些样品粘稠度较大，需要较高柱温，而本柱子跟岛津、安捷伦（70摄氏度可用）等其他色谱柱相比就有点受限了。

前些天柱子进过纯水之后，发现跑的峰型不稳，且多集中在前端，经售后维修得以修复，目前柱子使用情况良好，非常感谢。