主题：【资料】水产品中己烯雌酚残留量的测定

6 样品处理
6.1 试样提取
取出鱼、虾、蟹、鳖等水产品肌肉部分，除净脂肪和结缔组织，样品切成不大于长0.5cm、宽0.5cm、高0.5cm的小块后混匀，置冰箱中冷冻备用。
将样品解冻，取5g（精确到0.01g）样品于匀浆机的玻璃管中, 加10mL 67 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 7.2）,充分匀浆, 称取3g（精确到0.01g）匀浆组织于20mL玻璃离心管中, 加入8mL 叔丁基甲基醚, 强烈振荡20min，4000r/min离心10min，转移出上清液至20mL玻璃离心管中，再用8mL叔丁基甲基醚重复提取沉淀物，将两次提取的醚相合并，70摄氏度水浴蒸发至干。
取百分之70的甲醇1mL溶解干燥的残留物，加3mL石油醚洗涤甲醇溶液，漩涡混合１min, 4000r/min离心1min，吸除石油醚，置水浴锅中蒸发甲醇溶液，用1mL二氯甲烷溶解, 加1 mol/L氢氧化钠溶液3mL, 漩涡振荡后静置，取出上层氢氧化钠溶液, 加入6 mol/L 磷酸300uL中和提取液, 用C18 固相提取柱进一步纯化。
6.2 样品纯化
将C18固相提取柱垂直固定，用3mL无水甲醇洗涤柱子，再用2mL 百分之20甲醇的20mol/L Tris缓冲液（pH 8.5）平衡柱子，紧接着将上述用磷酸中和后的氢氧化钠提取液用1000uL微量加样器全部加入柱中，过柱，然后用2mL 百分之20甲醇的20mol/L Tris缓冲液（pH 8.5）洗涤柱子，接着用3mL 百分之40的甲醇洗涤柱子，弃去过柱的溶液，用正压去除残留的液体并且用空气或氮气吹2 min以干燥柱子。
用2mL 百分之80的甲醇洗脱样品（以上溶液洗柱、平衡柱和提取液过柱的流速皆为１滴/s左右，可用固相萃取器抽真空控制），收集洗脱液，向洗脱液中加入2mL水，取20uL进行酶联免疫测定。
7 酶联免疫测定
检查试剂盒中所有试剂是否齐全完好（参见附录A）。控制室温至20～24摄氏度,取出足够数量的微孔条插入微孔架中, 加入20uL的标准液和处理好的样品到各自的微孔底部, 记录各标准液和样品的位置, 标准和样品做两个平行实验。每个微孔中加入50μL稀释后的己烯雌酚抗体，微旋振荡混合,置 2～8摄氏度冰箱中孵育20h。
取出微孔架，回复到室温20～24摄氏度，洗板（甩出孔中的液体,将微孔架倒置在吸水纸上每行拍打3次,以保证完全除去孔中的液体。用250uL蒸馏水充入孔中，再次倒掉微孔中液体,再重复操作两次）,加入50uL 稀释的酶标记物到微孔底部，微旋振荡充分混合后，置室温孵育1h，再洗板后（同上述洗板方法），每个微孔中加入50uL基质和50uL发色试剂, 充分混合，并在室温暗处孵育30min，每个微孔中再加入100uL反应停止液，混合后在60 min内测量并记录每个微孔450nm处的吸光度值。
８结果计算
8.1 计算相对吸光度值
计算每个己烯雌酚标准液和样液的平均吸光度值，按公式（1）求出己烯雌酚标准液和样液的相对吸光度值：
　　　　　　　　　　　　　Ri 等于 Ai/A0×100　（1）
式中：
Ri－相对吸光度值，百分比；
A0－空白标准的吸光度值；
Ai－标准或样品的平均吸光度值。
8.2 绘制校正曲线
以计算的标准液相对吸光度值为纵坐标，以己烯雌酚浓度的对数为横坐标，绘制出己烯雌酚标准液相对吸光度值与己烯雌酚浓度的校正曲线（参见附录B），校正曲线在0.05~0.4ug/L范围内应当成为线性，相对应每一个样品的己烯雌酚浓度可以从校正曲线上读出。每次试验均应重新绘制校正曲线。
8.3 结果计算
在8.2 条绘制的校正曲线上读出的相对应每一个样品的己烯雌酚浓度乘以相对应的稀释系数（本标准所采用的稀释系数为４），即为试样中的己烯雌酚残留量。
9 检测限、回收率
９.1 检测限
本方法的检测限为0.6ug/kg。
９.2 回收率
　　本方法的回收率≥百分之70。
附录A
（资料性附录）
己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒
A.1 己烯雌酚酶联免疫定量测定试剂盒
己烯雌酚测定试剂盒由德国R-Biopharm公司制造
1）可用于测定肌肉，尿,　胆汁，粪便及肝脏中的己烯雌酚残留检测。试剂盒应保存在2～8摄氏度的干燥避光环境中，并在有效期内使用, 试剂变质应当弃掉
2）。所有试剂应达到室温20～24摄氏度后使用。每个试剂盒包括：
1×框架，96孔板（12条、8孔）包被有兔抗己烯雌酚的抗体（兔IgG抗体）。
6×标准液（1.3mL/瓶）， 为百分之40的己烯雌酚甲醇水溶液：0 ug/L，0.025 ug/L, 0.05ug/L, 0.1 ug/L, 0.2 ug/L ，0.4 ug/L。
1×己烯雌酚过氧化物酶标记物浓缩液（0.7mL）。
1×己烯雌酚抗体浓缩液（0.7mL）。
1×酶基质（7mL）：含有过氧化脲。
1×发色剂（7mL）：四甲基联苯胺。
1×反应停止液（14mL）：1mol/L硫酸。
1×缓冲液（25mL）。
A.2 己烯雌酚酶标记物的稀释
用试剂盒提供的缓冲液以1: 11的比例，在玻璃试管中稀释酶标记物浓缩液，轻轻地振摇，充分混匀后使用。（由于稀释的酶标记物稳定性不好, 所以只稀释实际需用量的酶标记物）。
A.3己烯雌酚抗体的稀释
用试剂盒提供的缓冲液以1: 11的比例，在玻璃试管中稀释抗体浓缩液，轻轻地振摇，充分混匀后使用。（由于稀释的抗体稳定性不好, 所以只稀释实际需用量的抗体）。

我问一下，己烯雌酚什么时候是农残了？

不好意思，发错位置了，请斑竹帮我转到相关板块

我看楼主有好多标准的电子版，那么请楼主多发这方面的材料阿。大家反映好的话就加精！！！

不知道楼主想要关于什么方面的电子版资料,我有的话就上传上来

好资料,谢谢楼主,支持加精奖励

关于药残方面的，尽可以传上来，不过己烯雌酚的酶联免疫法不好用