3 结果与讨论3.1实验条件优化净化方法本实验建立注射萃取式净化方法,将3mL
一次性注射器(无针头)连接0.22um
过滤头,将吸附剂填料装入,轻轻敲击使其密实,待净化。本法将净化与样品过滤膜整合成一步,具有前处理简便、高效的特点,提高了检测效率,检测灵敏度高。且装置非特殊装置,均为实验室常用材料,方便购置,成本低廉(图1
)。
蔬菜中的色素等杂质对待测组分的电离过程产生重要的影响。通过参考相关文献,实验研究了不同吸附剂对农药响应的影响。由于不同种类及用量的吸附剂对分析结果影响较大,试验中上样溶液中基质含量为1g/mL
。三种吸附剂的用量均根据实验室的日常用量来添加,根据典型的QuEChERS
方法采用50mg
用量。考察了不同类型固相吸附材料对萃取效果的影响,包括gcB
、C18
、NH2
、PSA
分散固相材料等,发现gcB
的净化效果最好,其次为C18
,综合各材料对目标物的回收率数据最终选择C18
吸附剂作为蔬菜中净化材料。与QuEChERS
方法分散固相净化的效果进行了对比(图2
),由于本实验注射式萃取类似于传统固相萃取的效果,明显净化效果要大于QuEChERS
分散固相净化。但操作简便性比传统 和QuEChERS
法有了很大提高。色谱进样条件对于本试验的目标物来说,试验采用含有10%
乙腈的水作为弱清洗溶剂,采用乙腈作为强清洗溶剂来清洗注射器。样品的进样体积在1~5μL
都可以,另外考察了在0.5μL
和0.2μL
进样体积的进样精度都不错,本试验选择1μL
进样,既保证了进样精度,又避免使过多的样品基质成分进入系统,从而减少了系统维护的压力,更大程度上保证了系统的重现能力。质谱条件选择各目标化合物的两对特征二级碎片离子来进行定性,假设干扰物也同时具有这两对离子对,那么将根据这两对离子对峰信号的丰度比例进行确证。以排除假阳性误差。MRM
扫描方式是灵敏度最高的质谱检测方式,能确保最低的检出限。本试验的定量扫描方式选择MRM
扫描方式,下图为各种化合物多反应监测TIC
离子谱图。
图3 各种目标化合物多反应监测TIC离子谱图
图4 各种目标化合物叠加TIC离子谱图
3.2 不同萃取材料的选择净化效果:蔬菜中的色素等杂质对待测组分的电离过程产生重要的影响。通过参考相关文献,实验研究了不同吸附剂对农药响应的影响。由于不同种类及用量的吸附剂对分析结果影响较大,试验中上样溶液中基质含量为1g/mL
。吸附剂的用量均根据实验室的日常用量来添加,根据典型的QuEChERS
方法采用50mg
用量。考察了四种不同类型固相吸附材料对韭菜样品净化效果的影响,包括氨基键合硅胶吸附剂(NH2
)、N-
丙基乙二胺吸附剂(PSA
)、十八烷基键合硅胶吸附剂(C18
)和石墨化碳黑(gcB
)四种分散固相萃取吸附剂,发现gcB
的净化效果最好(图5
),gcB
可去除植物提取液中的叶绿素和类胡萝卜素等色素,其次为C18
,然后是PSA
,效果最差的是NH2
。
图5 四种不同净化材料净化效果对比图(韭菜)
a: NH2;b: PSA; c: gcB; d: C18
农药目标物保留情况:比较了上述gcB
、C18
、NH2
、PSA
材料对蔬菜样品中目标物的保留吸附情况。表明,本试验待测物大多结构中含有苯环等官能团,虽然gcB
的净化效果最好,但大部分农药被吸附,回收浓度较低,尤其是在最前部分洗脱液中只有少部分农药被检出;PSA
可通过离子交换作用除去样品基质中的金属离子、部分脂肪酸和糖,但对哒螨灵、辛硫磷的保留很强,回收浓度较低,而C18
可有效去除糖类、脂肪酸等杂质,虽然它去除色素的效果没有gcB
显著,总体回收情况与PSA
相当,但净化效果要远远优于NH2
和PSA
。综合净化效果与回收浓度数据,本试验选择C18
吸附剂作为蔬菜中净化材料。有相关文献对水果中19
种酸性农药采用分散固相萃取净化,得出相似结果,研究了3
种分散固相萃取吸附剂对净化效果的影响,表明C18
可有效去除糖类等杂质,但去除色素的效果没有gcB
显著,PSA
对部分农药保留显著,并选择C18
作为吸附剂。3.3 洗脱溶剂及洗脱用量的选择用于液质分析,溶剂主要有乙腈与甲醇两种,由于本方法液相色谱使用的有机相为甲醇,为简便起见,洗脱液选用甲醇。本前处理方法定位于快速、简便、高效,因此,有两个要求:1
、洗脱液要求直接上样, 2
、洗脱液要求溶剂用量少,方便进样小瓶盛装。对洗脱过程溶剂用量对检测结果的影响进行了考察。洗脱分为三步,1mL
提取液上样为第一步;当液面至吸附剂上液面时,加入1mL
甲醇,稍等片刻使用另一进样瓶盛装;当液面至吸附剂上时,加入1mL
甲醇,稍等片刻使用第三个进样瓶盛装。将三个进样小瓶上机测试。结果显示:NH2
材料处理的第1 mL
洗脱液中农药含量占总共3mL
含量的70%-80%
(图2-6
);PSA
材料处理的第1mL
占总共3mL
的70%
左右(图7
);gcB
材料处理的农药有6
种第1 mL
中农药含量尚不足总3mL
洗脱液的10%
,有三种农药在80%
,其他四种在25%-50%
之间(图8
);C18
材料洗脱液除了哒螨灵、多菌灵、嘧霉胺在70%-80%
之间,其他农药第1 mL
含量则占总共3mL
的80%-90%
(图9
);结果为,C18
的前1mL
洗脱出的农药最多;除了gcB
外,前2 mL
能洗脱出99%
以上的目标物。试验确定为1mL
提取液+1mL
洗脱液进行洗脱。
3.4 线性范围在确定的条件下,将配制的一系列不同浓度的混合标准溶液进行测定(5
、10
、100
、200
、500ng/mL
),以各组分的峰面积对浓度(ng/mL
)绘制标准曲线。峰面积与其浓度均呈良好线性关系,r2均大于0.998(各化合物的线性方程、相关系数等略).3.5方法最低定量限选择最低校准点的图谱,选用信噪比较高的离子对,按照其峰面积以十倍信噪比计算本方法的定量限为0.02
~0.39μg/kg
。各添加浓度回收率在80%~120%
之间,三次重复的相对标准偏差(RSD , n=3
)各化合物均在15%
以下(见表1)。表1 芹菜中各农药的LOQs、平均回收率和相对标准偏差
4 结论建立了定量检测蔬菜中14种农药残留的UPLC/MS/MS
方法检测方法,提取采用乙腈提取、吸附剂注射萃取净化,对分离条件和质谱检测条件进行了优化,所试方法线性范围5~500ng/mL
相关系数r
2在0.99
以上,十倍信噪比计算本方法的方法定量限为0.03
~0.46 ng/L
。各添加浓度回收率在80%~120%
之间,三次重复的相对标准偏差(RSD , n=3
)各化合物均在15%
以下。该前处理方法具有前处理简便、高效,将净化与样品过滤膜整合成一步,提高了检测效率,检测灵敏度高,另外可对不同材料进行组合应用;相对于应用广泛的QuChERS
方法,更简便、更高效,经验证后可推广应用于其他产品的检测。部分参考文献:[1] Anastassiades M, Lehotay SJ, StajnbaherD
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