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主题：【原创】迪马饲料中氨基酸分析解决方案

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微雨燕双飞
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发表于：2014/08/13 14:15:40 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
天然氨基酸分析是食品、饲料和药品分析的重要项目。目前氨基酸分析常常采用这样两种方式：

1. 离子交换色谱分离-柱后衍生

2. 柱前衍生-反相色谱法分离

    后者以操作灵活、费用低廉而被广泛应用。在柱前衍生-反相色谱法分离中，异硫氰酸苯酯(PITC)和2,4-二硝基氟苯(DNFB)均可与一级胺、二级胺反应，是理想的柱前衍生剂。
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2014/8/13 14:17:29 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
    天然氨基酸多达20种，但由于蛋白质水解过程中天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸则以胱氨酸形式存在，因而对于含蛋白食品、饲料等样品的氨基酸分析时，只需分析Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)等18种氨基酸。

    PITC和DNFB均能与这些氨基酸生成稳定的衍生物。此外，DNFB还能对半胱氨酸进行衍生，对PITC衍生法是一个重要的补充，能够满足氨基酸注射液中涉及的19种氨基酸分析。
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2014/8/13 14:20:22 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
分析原理

    对于含蛋白样品(饲料、动物组织等)，先对样品进行酸水解或碱水解处理，得到游离氨基酸溶液，然后用合适的衍生剂进行柱前衍生，赋予氨基酸以疏水结构和吸收基团，然后使用反相液相色谱-紫外检测器分离并检测。

异硫氰酸苯酯(PITC)衍生法

    PITC与氨基酸在弱碱性条件(pH≈9.0)下反应生成噻唑啉酮苯胺衍生物，衍生物在反相柱上具有较强保留并在254 nm下具有明显吸收。
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2014/8/13 14:23:12 Last edit by godblesschina
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2014/8/13 14:22:13 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
样品处理

        饲料蛋白质水解(酸水解法)：饲料粉碎成细小颗粒，将一定量样品*置于20 mL旋盖(内衬PTFE隔垫)细口瓶，加入10 mL 0.1%苯酚+6 mol/L HCl水溶液，旋紧盖子，振荡混匀，110 ℃下反应24 h。

        反应完毕，将反应液全部转移到100 mL蒸馏瓶中，75 ℃下减压蒸馏至近干，以除去反应液中残余的HCl，然后用12 mL 0.1 mol/LHCl水溶液分三次溶解残渣，并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管，再用纯水定容至20 mL，待衍生。

* 样品中蛋白质量最好处于10 mg～40 mg之间

样品溶液衍生

        量取200 μL样品溶液，置于1.5 mL塑料离心管中，加入20 μL正亮氨酸内标溶液*，混匀，再加入100  μL  1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 μL 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1小时，然后加入400 μL正己烷，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层。

      取200 μL下层溶液与800 μL水*混合，0.22 μm针式过滤器过滤，待分析。
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2014/8/13 14:25:12 Last edit by godblesschina
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2014/8/13 14:31:56 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
氨基酸-PITC衍生物的分析条件
 
色谱柱:Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250×4.6 mm，5 μm
保护柱：EasyGuard C18，10×4.0 mm，5 μm
流动相A:0.05 mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05)
流动相B:甲醇 : 乙腈 : 水=20 : 60 : 20(V : V : V)
流速:1.0 ml/min
柱温:35 ℃
进样体积:10 μL

梯度洗脱
     
时间/min03940454660
流动相A/%9552009595
流动相B/%54810010055
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2014/8/13 14:34:04 Last edit by godblesschina
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2014/8/13 14:36:04 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊


PITC柱前衍生法分析饲料水解液中氨基酸的液相色谱图(图中的Nle为内标物)



由图可知除色氨酸(Trp)外，其余17种氨基酸全部检出，并达到较好分离。色氨酸无法检出是因为酸水解过程中，色氨酸被破坏，色氨酸分析时建议采用碱水解法。
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2014/8/13 14:36:48 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

化合物

mol/100 g饲料

质量分数/%

RSD(n=6)/%

Asp

0.0310

4.12

2.25

Glu

0.0520

7.65

1.42

Ser

0.0211

2.22

2.87

Gly

0.0370

2.78

2.64

His

0.0069

1.07

3.02

Arg

0.0193

3.36

1.93

Thr

0.0136

1.62

2.83

Ala

0.0254

2.26

3.15

Pro

0.0220

2.53

2.77

Tyr

0.0075

1.36

3.23

Val

0.0180

2.12

1.99

Met

0.0051

0.76

2.84

Cys-Cys

0.0009

0.21

3.46

Ile

0.0136

1.79

2.91

Leu

0.0247

3.24

0.98

Phe

0.0118

1.95

2.69

Trp

0

0

0

Lys

0.0218

3.19

2.26

总量

0.4170

43.48

2.44



    由表中数据可知氨基酸总含量为43.48%，与厂家标示的蛋白质含量43%相当。平行样品的氨基酸含量以及蛋白质含量的RSD均小于3.5%，表明该方法具有较高的重现性。

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2014/8/13 14:37:42 Last edit by godblesschina
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2014/8/14 14:34:26 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生法

原理

    在弱碱性、避光、60 ℃条件下，氨基酸上的α-氨基与DNFB发生Sanger反应，生成2,4-二硝基苯氨基酸。2,4-二硝基氨基酸在反相柱上具有较强保留并在360 nm下具有较强吸收。
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2014/8/14 14:35:48 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
样品处理

    饲料蛋白质水解(酸水解法)：饲料粉碎成细小颗粒，将一定量样品*置于20 mL旋盖(内衬PTFE隔垫)细口瓶，加入10 mL 0.1%苯酚+6 mol/L HCl水溶液，旋紧盖子，振荡混匀，110 ℃下反应24 h。

    反应完毕，将反应液全部转移到100 mL蒸馏瓶中，75 ℃下减压蒸馏至近干，以除去反应液中残余的HCl，然后用12 mL 0.1 mol/LHCl水溶液分三次溶解残渣，并转移到20 mL玻璃具塞刻度试管，再用纯水定容至20 mL，待衍生。

* 样品中蛋白质量最好处于5 mg-20  mg之间
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2014/8/14 14:36:20 Last edit by godblesschina
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2014/8/14 14:37:21 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
样品溶液衍生

    将0.5 mL样品溶液加入5 mL玻璃具塞刻度试管中，然后加入0.5 mL  0.1 mol/LNa2B4O7水溶液和1%DNFB乙腈溶液，具塞摇匀，然后于60℃下避光反应1 h。反应完毕将试管置于冷水中冷却，然后用0.02 mol/L Na2HPO4 + 0.02 mol/L NaH2PO4水溶液定容至5 mL，混匀后待检测。
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氨基酸-DNFB衍生物的分析条件
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