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主题：【求助】如何分离单抗轻重链

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CEcret
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2015/2/4 10:31:20 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 lingyou(v2983592) 发表:
SEC的方法实验过了，问题在于单抗用巯基乙醇处理后HPLC检测发现出现了非常高的聚体峰，也就是二硫键又重新组合了，导致轻重链含量很低。想加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。所以想问各位大神有没有其他的方法，试剂盒最好啦！新手，基础知识储备不足


有点糊涂了。。。你是要分离后收集么？如果这个是你的首要目的，那么CE的量是不足以让你收集的。在HPLC方法中，能够较好地保持蛋白原始形态的就是SEC，当然你可以很容易采用反相的手段分离HC,LC，但反相色谱是会使蛋白变性的，不存在收集后再分析的价值。

此外，cIEF的分辨率很高，所以会给出很多的charged variants的峰，你说的太复杂，不知道复杂到什么程度，能否上一张图我们看看。
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lingyou
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2015/2/4 11:20:11 12楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 CEcret(v2812644) 发表:
原文由 lingyou(v2983592) 发表:
SEC的方法实验过了，问题在于单抗用巯基乙醇处理后HPLC检测发现出现了非常高的聚体峰，也就是二硫键又重新组合了，导致轻重链含量很低。想加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。所以想问各位大神有没有其他的方法，试剂盒最好啦！新手，基础知识储备不足


有点糊涂了。。。你是要分离后收集么？如果这个是你的首要目的，那么CE的量是不足以让你收集的。在HPLC方法中，能够较好地保持蛋白原始形态的就是SEC，当然你可以很容易采用反相的手段分离HC,LC，但反相色谱是会使蛋白变性的，不存在收集后再分析的价值。

此外，cIEF的分辨率很高，所以会给出很多的charged variants的峰，你说的太复杂，不知道复杂到什么程度，能否上一张图我们看看。


是这样的，因为要制定一个企业标准，所以希望cIEF的谱图简单一些，好定量容易重现才好作为标准执行。现在cIEF十几个峰，分离度也不是很好，要把每个峰定量定性比较困难。所以就想能不能LC，HC分别进行分析，使谱图变简单。所以就需要将单抗还原然后分别收集LC，HC。

目前用巯基乙醇处理，SEC分析发现了很高的聚体峰；然后想巯基乙醇处理后加碘乙酰胺封闭二硫键，结果出现了沉淀。都没法回收LC，HC。所以求一个靠谱的能还原单抗收集LC，HC的方法，然后我再用cIEF检测。
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dooby
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2015/2/26 9:28:00 13楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
进来学习关注一下
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大师
shiyaohui
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2016/4/1 14:56:11 14楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
你分离重链轻链的目的是什么呢？分析电荷异质性吗？还是纯度分析？
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lingyou
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2016/4/5 8:11:51 15楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 大师(shiyaohui) 发表:
你分离重链轻链的目的是什么呢？分析电荷异质性吗？还是纯度分析？
分析电荷异质性。因为整体分析太复杂，所以想考虑分离后分别分析。你有什么好的分离方法吗？
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惜澈
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2016/5/6 14:05:30 16楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 lingyou(v2983592) 发表:
分析电荷异质性。因为整体分析太复杂，所以想考虑分离后分别分析。你有什么好的分离方法吗？
请问你们之前的cIEF是用Protein Simple的ICE做的吗？分析的是融合蛋白还是抗体还是ADC?一般单抗用ICE做出来的cIEF谱图不会太复杂啊，而且分辨率都还可以。建议你在优化cIEF的方法上下手，收集毕竟耗费精力而且纯度也是个问题。
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lingyou
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2016/5/9 8:23:31 17楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 惜澈(v3100857) 发表:
请问你们之前的cIEF是用Protein Simple的ICE做的吗？分析的是融合蛋白还是抗体还是ADC?一般单抗用ICE做出来的cIEF谱图不会太复杂啊，而且分辨率都还可以。建议你在优化cIEF的方法上下手，收集毕竟耗费精力而且纯度也是个问题。
这个产品本身比较复杂，而且用的也不是ICE，是贝克曼家的仪器。方法优化方面相对也困难
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CEcret
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2016/5/17 11:53:24 18楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
如果你是糖蛋白的话,可能修饰比较复杂,那么存在十几个形体也就不足为怪了
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lingyou
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2016/5/18 7:58:03 19楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 CEcret(v2812644) 发表:
如果你是糖蛋白的话,可能修饰比较复杂,那么存在十几个形体也就不足为怪了
是的，修饰位点比较多
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CEcret
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2016/5/18 8:48:42 20楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一般糖蛋白的策略是采用cIEF确定各个形体的等电点，采用区带代替cIEF进行快速鉴别。
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