主题：【求助】关于生物药SEC或者CEX方法验证

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间甲酚含量检测（HPLC法）

方法学验证报告

1. 间甲酚含量检测（HPLC法）验证用设备、材料
1.1验证用设备
1.1.1 高效液相色谱仪
1.1.2 电子天平（十万分之一）
1.2 验证用材料
1.2.1 间甲酚对照品（中检院，100mg，GC纯，99.0%，101153-201001）
1.2.2 色谱柱（Venusil，ASB-C18，粒径5μm，4.6mm×150mm）
1.2.3 重组人干扰素α1b注射液（300μg:3ml/支笔芯）（批号：20150101）
1.2.4 间甲酚空白对照样品：成品（20微克/支，批号：20141009）
1.2.5 乙腈（Fisher公司，HPLC级，批号：154450）
2. 间甲酚含量检测（HPLC法）验证实施
2.1 样品处理：
2.1.1间甲酚对照品母液：精密称取不少于10mg的间甲酚对照品，用0.01mol/L的盐酸稀释定容至25ml，制成每1ml中含间甲酚不小于0.40mg的对照品母液。
2.1.2间甲酚对照试液：精密量取间甲酚对照品母液，用0.01mol/L的盐酸稀释制成0.20mg的溶液，作为间甲酚对照试液。
2.1.3供试品试液：取重组人干扰素α1b注射液适量（300μg:3ml/支笔芯），用0.01mol/L的盐酸稀释制成每1ml中约含间甲酚0.20mg的溶液，作为供试品试液。
2.1.4间甲酚验证试液：精密量取间甲酚对照品母液，用0.01mol/L的盐酸稀释制成每1ml中约含间甲酚0.10mg的溶液，作为间甲酚验证试液。
2.2标准HPLC仪器参数：
2.2.1流动相：乙腈/硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加800ml水溶解后，加磷酸2.7ml、用乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000ml）：26/74。
2.2.2流速：1ml/min。
2.2.3进样量：20μl。
2.2.4检测波长：270nm。
2.2.5柱温：40℃。
2.2.6洗脱方式：等度洗脱。
2.2.7色谱图记录时间：15min。
2.3色谱积分参数
积分报告同时至少报告峰编号、保留时间、峰面积、峰高、理论塔板数、拖尾因子、分离度、信噪比。
2.4验证项目
2.4.1 系统适用性：用间甲酚验证试液进行2.2条件的HPLC分析，记录色谱图，至少连续进样五针。积分后考察：主峰理论塔板数（不小于2000）、主峰分离度及下一个峰分离度（均大于1.5，如果出现前一个峰积分时未计算峰宽导致后一个峰分离度无法计算，则要求前一个峰结束时间大于后一个峰起始时间）、信噪比（不小于10）、主峰拖尾因子（0.85～1.15）、重复性（不少于五次对照品主峰面积的相对标准偏差（不超过2.0%））。用2.4.6中第一天的数据。
2.4.2专属性
2.4.2.1空白溶液：用0.01M盐酸代替样品进行2.2条件的HPLC分析。积分后要求在间甲酚主峰处无色谱峰。
2.4.2.2间甲酚对照试液：用2.4.3中最低点第一样品数据。积分后要求在间甲酚主峰处有色谱峰。
2.4.2.3供试品试液：用2.4.5中最低点第一个样品数据。积分后要求在间甲酚主峰处有色谱峰。
2.4.3线性
根据标准间甲酚测试含量为0.20mg/ml，在其±50%范围内，设定五个点：含0.10mg/ml（50%），0.15mg/ml（75%），0.20mg/ml（100%），0.25mg/ml（125%），0.30mg/ml（150%）间甲酚的对照品供试液，进行2.2条件的HPLC分析，对主峰进行积分，以含量为横坐标（X），主峰峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析，计算线性方程，要求：R²大于0.998%，|截距/100%相应值| 不大于2.0%。
2.4.4准确度
用间甲酚空白对照样品和间甲酚对照品母液，配制含0.16mg/ml（80%）、0.20mg/ml（100%）和0.24mg/ml（120%）间甲酚的准确度供试液，各配制三个平行，按照上述方法进行分析，对主峰进行积分，按照2.4.3的线性方程计算回收率及相对标准偏差。要求：回收率均在98.0～102.0%，相对标准偏差不大于2.0%。
2.4.5精密度
用0.01mol/L的盐酸稀释重组人干扰素α1b注射液（300μg:3ml/支笔芯）制成含0.16mg/ml（80%）、0.20mg/ml（100%）和0.24mg/ml（120%）间甲酚的精密度供试液，各配制三个平行，按照上述方法进行分析，对主峰进行积分，按照2.4.3的线性方程计算校正因子，用校正因子计算相对标准偏差。要求：相对标准偏差不大于2.0%。
2.4.6日间稳定性（中间精密度部分）
用同一批流动相、测试样品，连续测试三天，每天均按照2.4.1要求进行分析。要求：每天均需满足2.4.1要求，且主峰保留时间的日内相对标准偏差不大于1.0%，日间相对标准偏差不大于1.0%，主峰峰面积日间相对标准偏差不大于3.0%。
2.4.7定量限
利用2.4.3线性的数据进行计算：先计算出标准曲线的斜率和剩余标准偏差，然后计算出定量限（LOQ=10×剩余标准偏差/标准曲线的斜率）。要求：不得高于0.10mg/ml（即：2.4.3线性测定下限）。
2.4.8耐用性
2.4.8.1不同流速
将2.2.2流速分别测定±0.2ml/min，即：流速分别为0.8ml/min和1.2ml/min，重新测定2.4.1。（其中，在测定0.8ml/min时，将记录时间延长至20min。）要求：2.4.1的要求依然符合。
2.4.8.2不同柱温
将2.2.5柱温分别设定±5℃，即：柱温分别为35℃和45℃，重新测定2.4.1。要求：2.4.1的要求依然符合。
2.4.8.3不同流动相的pH值
将2.2.1流动相pH值分别配制成±0.2，即：pH值调节为2.1和2.5，重新测定2.4.1。要求：2.4.1的要求依然符合。
2.4.8.4不同流动相的组成
将2.2.1流动相的乙腈与硫酸盐缓冲液比例波动范围为±5%配制流动相，即：乙腈/硫酸盐缓冲液比例为：21/79和31/69，重新测定2.4.1。要求：2.4.1的要求依然符合。

3. 合格判定标准

表一：合格判定标准

验证项目	合格标准
系统适用性	1、主峰理论塔板数（不小于2000） 2、主峰分离度及下一个峰分离度（均大于1.5） 3、信噪比（不小于10） 4、主峰拖尾因子（0.85～1.15） 5、重复性（相对标准偏差不大于2.0%）
专属性	1、空白溶液：在间甲酚主峰处无色谱峰。 2、间甲酚空白对照试液：在间甲酚主峰处无色谱峰。
线性	1、R2大于0.998% 2、|截距/100%相应值| 不大于2.0%
准确度	1、回收率均在98.0～102.0% 2、相对标准偏差不大于2.0%
精密度	1、相对标准偏差不大于2.0%
日间稳定性	1、主峰理论塔板数（不小于2000） 2、主峰分离度及下一个峰分离度（均大于1.5） 3、信噪比（不小于10） 4、主峰拖尾因子（0.85～1.15） 5、主峰峰面积的日内相对标准偏差（不大于2.0%） 6、主峰峰面积的日间相对标准偏差（不大于3.0%） 7、主峰保留时间的日内相对标准偏差（不大于1.0%） 8、主峰保留时间的日间相对标准偏差（不大于2.0%）

表一：合格判定标准（续）

验证项目	合格标准
耐用性-1   不同流速	1、主峰理论塔板数（不小于2000） 2、主峰分离度及下一个峰分离度（均大于1.5） 3、信噪比（不小于10） 4、主峰拖尾因子（0.85～1.15） 5、重复性（相对标准偏差不大于2.0%）
耐用性-2   不同柱温	1、主峰理论塔板数（不小于2000） 2、主峰分离度及下一个峰分离度（均大于1.5） 3、信噪比（不小于10） 4、主峰拖尾因子（0.85～1.15） 5、重复性（相对标准偏差不大于2.0%）
耐用性-3   不同流动相   的pH值	1、主峰理论塔板数（不小于2000） 2、主峰分离度及下一个峰分离度（均大于1.5） 3、信噪比（不小于10） 4、主峰拖尾因子（0.85～1.15） 5、重复性（相对标准偏差不大于2.0%）
耐用性-4   不同流动相   的组成	1、主峰理论塔板数（不小于2000） 2、主峰分离度及下一个峰分离度（均大于1.5） 3、信噪比（不小于10） 4、主峰拖尾因子（0.85～1.15） 5、重复性（相对标准偏差不大于2.0%）

这是一个辅料（间甲酚）含量测定方法的验证前半部分，后面就是实验数据及结果，以及结论了。

方法是反相的，看看能否改成SEC的或者IEC的。