2.5 结果计算
用色谱数据处理机或按式(2)分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量。
2×ci×V
ω= …… (2)
m
ω-水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量,μg/kg;
ci -标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准工作溶液的浓度,μg/L;
V-最终定容体积数,mL;
2-换算常数;
m-供试试料样品重量,g。
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*1)提取剂1是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称,由有机化学试剂组成的混和液体试剂,其作用是将样品中的待测物有效地提取出来。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。
*2)提取剂2是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称。由无机化学组成的混和粉状试剂,其作用是助提及去除杂质和脂肪。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。
本方法分别计算孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿,并分别报告孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿结果。
本方法分别计算结晶紫及代谢产物隐色结晶紫,并分别报告结晶紫及代谢产物隐色结晶紫结果。
3 测定低限、回收率
3.1 检测限
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测限均为2.0μg/kg。
3.2 回收率
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率为:85%~105%。
4
液相色谱-串联质谱法
4.1 原理
试样中残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提供的试剂提取、浓缩后用
液相色谱-串联质谱进行检测,外标法定量。
4.2 试剂和材料
除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为重蒸馏水。
4.2.1 乙腈:色谱纯。
4.2.2 无水乙酸铵。
4.2.3 冰乙酸:色谱纯。
4.2.4 异丙醇。
4.2.5 5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液:称取0.385 g无水乙酸铵,溶解于大约980 mL水中,用冰乙酸调节pH到4.5,最后用水定容到1000 mL,过0.2 µm滤膜。
4.2.6 标准品: 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于98 %。
4.2.7 标准贮备溶液:准确称取孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10mg,用乙腈分别溶解定容于100 mL容量瓶中,配制成100 µg/mL的标准贮备液。
4.2.8 混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液,配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10 µg/mL的混合标准溶液。0℃~4℃避光保存。
4.2.9 孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒* 。
4.3 仪器和设备
4.3.1 高效
液相色谱-串联质谱联用仪:配有电喷雾(ESI)离子源。
4.3.2 匀浆机。
4.3.3 旋转蒸发仪。
4.3.4 离心机:4000 r/min、8000 r/min。
4.3.5 振荡器。
4.3.6 超声波水浴。
4.3.7 聚四氟乙烯离心管:2.5 mL,50 mL,带塞。
4.3.8 微孔滤膜:0.45 µm。
4.4 测定步骤
4.4.1 提取和净化
准确称取已捣碎的样品5.00 g于50 mL离心管中,先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中
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*孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒是由中国检验检疫科学研究院研发,北京陆桥商检新技术公司所生产产品的商品名称,给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。
的提取剂1*(液体20.0 mL),用匀浆机以8 000 r/min的速度均质30 s,再加入提取剂2*(固体粉末), 振荡1 min,4 000 r/min离心5 min,取上清液10.0 mL于鸡心瓶中再加入异丙醇10 mL, 50℃~55℃水浴旋转蒸干。残留物用2.5 mL流动相溶解,溶解液放入2.5 mL离心管中,8000 r/min离心5 min后,用微孔滤膜过滤,滤液供仪器测定。
4.4.2 绘制标准工作曲线
移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫混和标准溶液,用流动相稀释成0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL标准工作溶液,用高效
液相色谱-串联质谱仪测定,得出标准工作曲线。
4.4.3 测定
4.4.3.1 高效
液相色谱-串联质谱条件
a) 色谱柱:C18柱,150 mm×2.1 mm(i.d.),粒度5 µm;
b) 流动相:乙腈+5 mmol/L乙酸铵(75+25,V/V);
c) 流速:0.2 mL/min;
d) 柱温:35℃;
e) 进样量:10 µL;
f) 离子源:电喷雾ESI,正离子;
g) 扫描方式:多反应监测MRM;
h) 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气;使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到要求;
i) 喷雾电压、去集簇电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度;
j) 监测离子对:孔雀石绿m/z 329/313(定量离子)、329/208;隐色孔雀石绿m/z 331/316(定量离子)、331/239;结晶紫m/z 372/356(定量离子)、372/251;隐色结晶紫m/z 374/358(定量离子)、374/238。
4.4.3.2
液相色谱-串联质谱定量测定
按照2.4.2.1
液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液,标准曲线法测定样液中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫含量。样品中被测物残留量应在标准曲线范围之内,如果含量超出标准曲线范围,应用流动相适当稀释。在上述色谱条件下, 孔雀石绿 、结晶紫 、隐色孔雀石绿 、隐色结晶紫的保留时间约为1.89 min、5.35 min、2.47 min和5.51 min。标准溶液的
液相色谱-电喷雾质量色谱图见附录B中的图B.1。
4.4.3.3
液相色谱-串联质谱定性测定
按照2.4.2.1
液相色谱-串联质谱条件测定样品和标准工作溶液,分别计算样品和标准工作溶液中两对离子对色谱峰面积的比值,仅当两者数值的相对偏差小于25%时方可确定两者为同一物质。
4.5 空白试验
除不加试样外,均按上述测定步骤进行。
4.6 结果计算表述
按式(1)分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫残留量,计算结果需扣除空白。
2×ci×V
ω= …… (1)
m
ω-水产品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫或隐色结晶紫残留量,µg/kg;
*1)提取剂1是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称,由有机化学试剂组成的混和液体试剂,其作用是将样品中的待测物有效地提取出来。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。
*2)提取剂2是孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒中试剂商品名称。由无机化学组成的混和粉状试剂,其作用是助提及去除杂质和脂肪。给出这一信息是为了给本标准的使用者提供方便,而不是标准主管部门对这一产品的认可。
ci -标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫的标准工作溶液浓度,µg/L;
V-最终定容体积数,mL;
2-换算常数;
m-供试试料样品重量,g。
本方法分别计算孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿,并分别报告孔雀石绿及代谢物隐色孔雀石绿结果。
本方法分别计算结晶紫及代谢物隐色结晶紫,并分别报告结晶紫及代谢物隐色结晶紫结果。
5 测定低限、回收率
5.1 测定低限
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的检测低限均为0.5 µg/kg。
5.2 回收率
本方法孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫回收率均为:85%~105%;
附 录 A
(资料性附录)
标准品色谱图
图A.1 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫混合标准品的
液相色谱图
附 录 B
(资料性附录)
标准品
液相色谱-电喷雾质量色谱图
图B.1孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫
液相色谱-电喷雾质量色谱图