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液相色谱（LC）
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主题：【已应助】标准品液相色谱问题求助

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Ins_3f6c1afd
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发表于：2022/07/05 04:10:12 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
各位大佬们，最近在用液相色谱测叶酸，流动相用的是乙腈-30mM磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液用的是磷酸二氢钾和磷酸二氢钠，用磷酸调PH到2.3。
从sigma买的标品，当时也没想好，就随便溶了一点点，来做标准品的出峰时间。
每次都是从高度往低浓度稀释来进样，高浓度的时候还好，稀释100到600倍，虽然会出现平头峰1，但是峰面积是逐渐下降的。问题就出在低浓度的时候，比如稀释800倍以后，相同的保留时间但是峰面积确实和高浓度时候一样，甚至出现平头峰，真的哭了。标准品的峰不应该是主峰吗，而且，逐级稀释的话，峰面积不是应该越来越小吗。搞不懂，真心求助。
各位大佬，结果请看附件
附件：
xyk22.07.01THF标品多个浓度梯度HPLC.pdf
推荐答案：Ins_3f6c1afd回复于2022/07/12
兄弟们，已经做出来了，重新测量并溶解了标准品，现在得到了线性的结果。CK是溶剂进样，造成溶剂峰峰面积大的原因是，我的溶剂是磷酸盐缓冲液，放得太久了就出现了溶剂峰增大，现配现用就没有问题。
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2022/7/5 9:28:23 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
可能高浓度样品有残留导致的污染吧。

不同意楼主的进样顺序，最好是从低到高来检测，避免有残留对后续样品有影响。
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2022/7/5 9:30:12 Last edit by dahua1981
xiaogumd11
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2022/7/5 9:42:56 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第一有没有稀释错？第二，稀释后不成线性，有没有其他物质带入或干扰?第三平头峰可能是熔剂峰？
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歌名
Ins_eedcdc41
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2022/7/5 9:45:49 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.CK是啥？试剂空白还是系统空白？还是空白PB提取液？CK中13.7为什么峰型明显？
2.建议做一个试剂空白和系统空白，再用标液来定出峰时间，标液最好称量准确，浓度已知，否者没法定线性范围和估计检出限定量限。
3.RT一直在往前漂，坐下稳定性实验看看吧。
4.看了你的色谱图，从1000X到10000X就有问题，不成线性，峰面积降低的老厉害了，检查一下样品位置和序列编辑位置是否有误。
5.从1000X的峰高出现平头峰来看，这个化合物响应估计不会太好，峰高太低，CK中又有干扰，条件允许的话建议换一个检测方法。
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ztyzb
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2022/7/5 9:48:13 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主用本台设备做其他指标结果如何？
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xiaolanzi5
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2022/7/5 11:07:51 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
要判断目前您认为的目标物是不是真的叶酸峰。
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Ins_3f6c1afd
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2022/7/5 21:35:04 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 ztyzb(zxz19900120) 发表:
楼主用本台设备做其他指标结果如何？
之前实验室其他人做了其他物质标品的检测，是没有问题的，我明天准备换一个柱子看看是否真的是溶剂峰与物质峰重叠吧
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Ins_3f6c1afd
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2022/7/5 21:35:54 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 wuyuzegang(dahua1981) 发表:
可能高浓度样品有残留导致的污染吧。

不同意楼主的进样顺序，最好是从低到高来检测，避免有残留对后续样品有影响。
ok，我明天试一试从低到高检测
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Ins_3f6c1afd
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2022/7/5 21:44:59 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xiaogumd11(v3247983) 发表:
第一有没有稀释错？第二，稀释后不成线性，有没有其他物质带入或干扰?第三平头峰可能是熔剂峰？
稀释倍数是没有问题的，结果就是显示不成线性，做了两次都是这样，但稀释倍数增大后，平头峰的峰面积也会下降，我也不知道啥原因，现在考虑的是溶剂峰和物质峰是不是重叠在一起了，我把测的物质峰面积做了图，CK是用溶剂溶的，加了巯基乙醇和抗坏血酸钠。
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Ins_3f6c1afd
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2022/7/5 21:49:40 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 歌名(Ins_eedcdc41) 发表:
1.CK是啥？试剂空白还是系统空白？还是空白PB提取液？CK中13.7为什么峰型明显？
2.建议做一个试剂空白和系统空白，再用标液来定出峰时间，标液最好称量准确，浓度已知，否者没法定线性范围和估计检出限定量限。
3.RT一直在往前漂，坐下稳定性实验看看吧。
4.看了你的色谱图，从1000X到10000X就有问题，不成线性，峰面积降低的老厉害了，检查一下样品位置和序列编辑位置是否有误。
5.从1000X的峰高出现平头峰来看，这个化合物响应估计不会太好，峰高太低，CK中又有干扰，条件允许的话建议换一个检测方法。
CK是用的空白PB提取液，因为叶酸很容易氧化，所以得加抗坏血酸钠和巯基乙醇，CK的峰明显可能是溶剂峰。系统空白怎么做呢，流动相是乙腈-30mM磷酸盐缓冲液PH2.3。当然标准品肯定得重新称量好计算含量。保留时间我也发现在变化，怎么做稳定性实验呢，我也是新手来着。样品位置和序列编辑位置我下来查查怎么搞。谢谢解答
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2022/7/5 21:50:48 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 xiaolanzi5(xiaolanzi5) 发表:
要判断目前您认为的目标物是不是真的叶酸峰。
谢谢解答，我换个柱子再测看看
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