生物实验中的基础操作—铺板，流式及蛋白浓度测定

铺板

以每孔1×10⁴个细胞平铺于96孔板中，37 °C恒温培养箱中培养。铺板后，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h在每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 °C恒温培养箱中孵4 h。并用酶标仪测定波长450 nm处OD值，利用Graphpad prism5计算增殖情况。

流式细胞术

1. 收集对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞)，收集1-10 ×10⁵ 个细胞，用预冷PBS离心洗涤。用双蒸水稀释5×Binding Buffer为1 ×工作液，取500 μL 1 × Binding Buffer 重悬细胞。

2. 每管加入5 μL Annexin V-APC 和10 μL 7-AAD。

3. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5 min。

4. 上机进行分析。

细胞总蛋白质提取，测定蛋白浓度及蛋白变性

将对数生长期的对照组及实验组细胞移入15 mL 离心管中，900 rpm/min 离心 8 min，并用 PBS 溶液洗涤 2 次，以去除培养基中血清的影响。分别加入 100 μL 蛋白裂解液，与细胞充分混匀。冰上裂解1小时后，4°C，12000 rpm/min 离心 15 min，将上清移至新的离心管中，得到细胞总蛋白，并采用 BCA 法测定蛋白浓度。

蛋白免疫印迹实验

配制浓度为10%或12%的分离胶，加入最后TEMED试剂搅拌均匀后，迅速灌胶，用乙醇压齐分离胶。待分离胶凝固后，弃去上层的乙醇，用滤纸将乙醇吸干，注意不要将纸屑污染胶板。配制浓缩胶，插入梳子，待胶凝固。开始凝胶电泳实验，缓慢拔出梳子，将胶夹紧放入电泳槽，槽内倒入电泳液，蛋白样品以等质量上样，按照实验设计加入蛋白 Marker和1×上样缓冲液。上层胶用60 V电压，样品跑至下层分离胶时，电压调至90 V，继续跑胶至蓝线到达分离胶底部停止。将 PVDF 膜浸泡在甲醇中约 30 s 激活后备用。将转膜夹板、滤纸、胶按照“黑板—滤纸—凝胶—PVDF 膜—滤纸—白板”的顺序夹好备用，注意每一层避免产生气泡。转膜槽中放入夹板，周围放入冰袋，倒入转膜液，恒流 200mA 转膜 2.5 h（转膜时间根据分子量大小设置）。用TBST配制5%牛奶封闭液对 PVDF 膜进行封闭，转膜完成后，将转好的膜放入封闭盒内，倒入牛奶封闭液，室温，摇床上慢摇孵育 2 h。洗膜: TBST 洗 3 次，每次10 min。配制一抗，4 °C 孵育过夜。洗膜，配制二抗，室温静孵 1 h。TBST 洗 3 次，每次 10 min。配制 ECL 发光液，室温条件下孵育 3 min，ECL 显影，化学发光成像仪曝光，保存图片。

附件：

2-5 生物实验中的基础操作—铺板，流式及蛋白浓度测定 .docx(未验证)