亚硝酸盐广泛存在于食品之中,很容易与胺化合,生成亚硝胺。亚硝胺与苯并芘、黄曲霉素是世界公认的三大强致癌物质。长期小剂量食用含亚硝胺的食品就可以使人致癌。下面介绍几种常用的N-亚硝胺类化合物的检测方法。
气相色谱法(Gas Chromatography,GC)GC是检测N-亚硝胺类化合物比较传统的方法,其检测器一般采用火焰电离检测器(Flame Ionization Detector,FID)。彭俏容在测定啤酒中的NDMA中就用到带火焰电离检测器的
气相色谱(GC-FID)的检测方法。啤酒样品先进行冷冻熔炼前处理,再上机分析,分析得出NDMA在5 mg/L~200 mg/L范围内具有良好的线性关系(r
2=0.999 6),仪器的检出限(Limit of De tection,LOD)为0.51 mg/L,方法的定量限(Limit of Quantitation,LOQ)为 1.26mg/L,在5、10、20mg/L3个加标水平下的回收率分别为84.94%、83.24%、85.14%,平行7次测定的相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分别为3.06%、3.19%、2.63%。熊凤娇
[21]在分析鱼糜制品中挥发性N-亚硝胺含量时,用安捷伦7890A
气相色谱仪测定。得到10种鱼糜制品中普遍存在8种挥发性N-亚硝胺:NDMA(0.2μg/kg~18.2μg/kg)、NMEA(0μg/kg~12.8μg/kg)、NDEA(0.6μg/kg~23.6μg/kg)、NDPA(0.2 μg/kg~5.9 μg/kg)、NDBA(0 μg/kg~14.8 μg/kg)、NPIP(0 μg/kg~1.7 μg/kg)、NPYR(0 μg/kg~8.7 μg/kg)及 NMorPh(0.5 μg/kg~5.0 μg/kg)。NDPhA 仅在虾丸中检出,含量为(6.0±1.7)μg/kg。GC虽然分析简便快捷,但由于其必须用已知物与相应的色谱峰进行对比,依靠保留时间定性,缺乏特异性。在样品基质比较复杂的情况下亚硝胺的分析效果不理想。
气相色谱-质谱联用法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry ,GC-MS)GC-MS不仅利用了色谱高效的分离能力,而且还发挥了质谱好定性的特点,大大提高了定性的准确性,灵敏度比GC-FID大大提高了。
GC-MS检测亚硝胺实验条件及检测情况见表3。
气相色谱—热能分析仪法(Gas Chromatography-Thermal Energy Analyzer,GC-TEA)热能分析仪是一种氮专属检测器,对氮具有等摩尔响应,灵敏度高、特异性好、线性范围宽等特点。张红
[26]等在测定水产品中亚硝胺时使用GC-TEA,样品经蒸馏、萃取、浓缩后上机分析得到四种挥发性N-亚硝胺线性范围是 0.2 μg/mL~4.0 μg/mL,线性相关系数R
2最高的是NDMA,R
2为0.999 4,方法检出限为0.001 mg/kg。冯新昌
[27]使用GC-TEA测定食品中的挥发性亚硝胺,其中108份样品检出亚硝胺,主要为NDMA,平均含量为0.83 μg/kg,在抽检的52份肉制品当中,香肠的亚硝胺平均含量最高,NDMA平均含量为1.10 μg/kg,NDEA 平均含量为 0.005 μg/kg,NPYP 平均含量为0.44 μg/kg。GC-TEA作为现行国标亚硝胺检测的第一法,相比其它检测方法有很大优势。GC使用FID检测器检出限只能达到mg/kg级别,当
GC-MS连用后其检出限才能达到ppb级别。由于FID检测器缺乏特异性及灵敏度,在定性和定量亚硝胺时存在着不小的难度,其方法已经被
GC-MS取代。
GC-MS与GCTEA相比,两个实验方法的灵敏度相同,但在处理基质比较复杂的样品时候,尤其存在相似性质物质干扰时,
GC-MS结果的稳定性和重现性就比不上GCTEA,因此在处理基质比较复杂的样品时,
GC-MS比GC-TEA要对样品多进行一步净化前处理,实验步骤比GC-TEA麻烦,实验成本也较高。
高效液相色谱-质谱联用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)复杂基质样品进行多种亚硝胺成分检测时,使用
GC-MS方法很难得到满意结果。有些亚硝胺不易挥发,热稳定性差,
GC-MS对于这类亚硝胺无法检测,其次对于含多种亚硝胺、物质成分较为复杂的样品
GCMS的分离效果不尽如人意。对于
GC-MS这些局限性,HPLC可以更好的分离,尤其是热稳定性差的亚硝胺,而HP
LC-MS的联用可以在分离的基础上进行定量分析。用HPLC分析肉制品中亚硝胺类化合物时,洪凰
[28]将样品与氯化钠水溶液混合进行蒸馏,馏出液过Ambersorb 572 SPE柱。然后洗脱,氮吹浓缩。浓缩液再进行脱亚硝基化反应后,乙腈定容,过有机滤膜待测。色谱柱选用ODS-2 Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm,5 μm),柱温 30 ℃,进样体积 50μL,流速 1.0 mL/min,流动相为乙腈-水(体积比55∶45),激发波长350 nm,发生波长530 nm。NDMA检出限为0.5 μg/kg、NDEA和NPIP检出限均为2.0 μg/kg。相比于食品,水中亚硝胺的检测前处理较简单,钱静汝
[29]把水样过滤后经固相萃取,浓缩和富集后上
液质,得到NDMA在1 μg/L~50 μg/L线性范围内,相关系数R
2>0.998。同样朱翔
[30]用超高效
液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,UP
LC-MS/MS)检测水中9种亚硝胺,也得到良好的检测结果,9种亚硝胺检出限范围是1.3 ng/L~2.8 ng/L,定量限范围是4.0 ng/L。
二次展开光解薄层层析法亚硝胺对光敏感,在光照条件下就可以发生催化降解。Preussmann等率先使用薄层层析法检测亚硝胺。魏天俊等在此基础上提出二次展开光解薄层层析法,其先用无氧乙醚萃取亚硝胺,再将萃取浓缩液滴至活化后的硅胶板上,待溶剂上升到距离原点3 cm~4 cm时,使用无滤光片的紫外分析灯照射10分钟后,再等溶剂上升到距原点10 cm处,喷Griess试剂进行显色。如果样品中含有亚硝胺,则在距原点不足3cm处就有玫瑰红色斑点出现。