主题：【分享】【金秋计划】系统扩散、梯度配比精度及其对质谱结果的影响

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发表于：2024/09/11 22:39:10 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

众所周知，超高效液相色谱系统的流路设计质量对色谱分离的外观和重现性有重大影响，这一点也适用于液相色谱-质谱联用（以下简称 LC-MS）应用中的梯度洗脱。不过，在 LC-MS 的情况下，洗脱条件通常更多地是：根据离子源的要求而非最佳色谱分离的要求进行调整；不过，这使得某些效果比传统的液相色谱独立应用更为明显，下文将详细讨论。

存在的挑战

在实际样品的 LC-MS 分析中，一个特殊的挑战是:样品溶剂与分离起始梯度溶剂强度之间的差异，即所谓的溶剂不匹配。许多样品制备方法最终会将分析物置于有机物比例较高的溶剂中，例如从食品中萃取农药的 QuEChERS 萃取法，通常会将分析物浓缩在纯乙腈中作为进样溶剂。但在反相色谱中，乙腈的溶剂强度较高，因此溶解在纯乙腈中的样品很难保留在反相色谱柱上；这主要影响极性化合物。如果进样体积段在从进样器到色谱柱的过程中没有被流动相充分稀释，那么分析物到达柱头时就会处于非常非极性的环境中，从而导致柱头保留不足或根本无法保留。

这种影响在专为超高效液相色谱和 LC-MS 分离而设计的液相色谱仪中尤为明显，因为这些系统经过优化，可将柱外扩散降至最低，以尽量减少色谱峰展宽，尤其是在使用相当小的色谱柱内径和低流速时。样品在进样器和柱头之间的低扩散性正好与样品溶剂与流动相的强混合性相反。这就会对早期洗脱的化合物产生各种影响，包括色谱峰变宽和扭曲（前沿），保留时间不稳定，甚至出现色谱峰分裂。

不过，这种影响可以通过各种方法来解决。最简单的方法是：减小进样体积。较小体积的色谱段更容易与毛细管中直至柱头的流动相混合，从而改善保留和峰形。这种方法还可用于检测所观察到的峰形扭曲是否是由溶剂不匹配引起的。其明显的缺点是，由于进样量减少，注入色谱柱的物质减少，从而降低了检测器信号的强度。

另一种方法是，在进行 LC-MS 分析之前，用水等弱溶剂稀释样品溶液。这一方面降低了溶剂强度，另一方面也降低了样品浓度，从而对信号强度和浓度敏感型检测器的检测限产生负面影响。此外，这还增加了样品制备的步骤，而且根据分析物的特性，如果样品溶剂的极性增加，降低了非极性物质的溶解度，还可能导致样品成分的部分沉淀。

为了在不对检测产生负面影响的情况下改善进入色谱柱过程中的体积混合，在进样器和色谱柱之间安装一个额外的混合元件是非常有用的。即使是一个仅含过滤片的过滤器，也能使流动相与样品体积段发生额外的混合，从而显著改善峰形，使保留时间更加稳定。

可能出现的任何额外的谱带展宽，大部分都会通过分析物在初始流动相组成中的柱头处重新聚焦（也称为色谱峰压缩）来补偿。在这里，只有混合体积对梯度延迟体积的贡献可被称为副作用。

然而，在 LC-MS 典型流速为 200-600 μl/min 时，10 至 30 μl 的混合体积对梯度延迟的影响微乎其微。一个技术上复杂得多的解决方案是将流动相的总流量分成两部分，并使用第二个泵或切换阀将总流量的较大部分输入进样器后面的流路系统。因此，样品量仅以总流量的一小部分进入进样器，然后将流量较大的部分加入进样器和分离柱之间。这一过程可有效稀释流动相中的样品。这种设计避免了梯度的额外延迟，但比之前的方法更昂贵，而且只适用于自动进样器中体积相对较小的管路。

此外，流量输送和梯度混合的精度也会对 LC-MS 的应用产生显著影响。究其原因，质谱仪通常无法以最高性能覆盖整个测量范围。与光学物镜类似，质谱仪要么扫描整个质荷比（m/z）检测范围，但这样就失去了细节的"聚焦深度"。或者，对可用 m/z 区域的个别部分进行高分辨率测量，但代价是忽略了全局。

这一事实背后的秘密在于，当今几乎所有常见的质量分析器都是作为质量过滤器工作的，它们按顺序扫描可用的测量范围，然后根据单个扫描结果重构整体图像。为了确保已知分析物的最低检测限（定量分析），定量分析的主要目的是将尽可能多的数据采集时间（驻留时间）专门用于目标化合物的质荷比（m/z）。在这种情况下，色谱分离的时间窗口会被细分为若干段，这些段落围绕相关化合物的保留时间进行分组，在这些时间窗口内，质谱仪仅以适用于目标分析物的质量滤波设置获取数据。根据仪器制造商的不同，这种操作模式被称为分段 SRM 或分段 MRM，广泛应用于串联 MS/MS 设备中食品安全污染物的痕量分析，例如水果、蔬菜或谷物中农药的测定。

实际上，在确定 SRM (MRM) 时间段的宽度以测量目标分析物的质荷比时，超高效液相色谱系统的精密度现在发挥着经常被监督的作用。为了准确无误地测定色谱峰中的分析物浓度，色谱峰至少要有 10-15 个数据点。由于色谱柱内外的扩散效应，化合物区越宽，色谱图中的峰越多，洗脱物质的保留时间精度越差，因此必须选择更宽的 SRM 时间窗口来检测相关化合物。举例来说，最先进的低扩散超高效液相色谱系统可提供低至 0.01% RSD 或更低的高精度保留时间，从而使定时 SRM 时间窗从传统 LC-MS 分析的 30 秒缩短到 10 秒以内，这对每种物质的数据点数量产生了积极影响。

然而，理论上听起来微不足道的问题，在实践中却对超高效液相色谱泵的设计和操作提出了复杂的挑战。要在从每分钟几十微升到每分钟几毫升的宽流量范围内提供总流量以及保留时间精度为百分之几百的流动相成分，需要复杂的仪器和控制技术，其数据处理速率要达到千赫兹范围，以处理泵流路中压力条件的传感器值，活塞驱动装置中的精密机械可以在纳升范围内精确调整活塞的位置。

因此，目前的超高效液相色谱仪是真正的高科技仪器，其精密度远远超过著名的瑞士钟表。不过，尽管这类液相色谱系统的设计声称尽善尽美，但仍有两个未知变量有可能严重干扰这种微妙平衡的精密度，它们就是制造公差和不可避免的元件磨损。传统的液相色谱分离通常以每分钟数百微升到数毫升的流速进行，这些干扰几乎不明显。但在液相色谱-质谱分离中，总流量通常远小于 500 uL/min，梯度仅从一种流动相组分的百分之几开始，并且/或者梯度斜率非常平缓，因此影响的大小会发生显著变化。

案例说明

让我们看一个实际例子来更好地理解这一点。无论制造商是谁，每个超高效液相色谱泵的磨损部件都是：入口和出口单向阀以及密封环，它们将活塞和泵头密封起来，使其免受环境影响。明确地说：尽管制造商在市场营销中作出了各种美丽的承诺，但每台超高效液相色谱泵都会泄漏。单向阀在微观层面上的密封性永远不会达到 100%。优秀阀门的典型泄漏率为每分钟几纳升，而磨损阀门的泄漏率则可达 400-500 nl/min。

活塞密封件也是如此，活塞密封件会随着时间的推移而磨损，磨损的原因是活塞摩擦力和充填时的机械变形；因此，活塞密封件的泄漏率显然也不是一个常数，而是会随着时间的推移而增加。因此，在泵送活塞腔的压缩物质时，并非所有的液体都会被推向色谱柱；有一小部分液体会通过泄漏回到溶剂管路或后密封清洗系统中，从而导致总流量不足。虽然对分离的影响因超高压液相色谱泵的设计原理而异。

二元高压梯度泵 (HPG) 通过两个泵头的相对流速来控制总流量和流动相成分。进出口阀门或活塞密封件上的微泄漏会导致总流量和所需溶剂成分偏离额定值。相反，四元低压梯度泵（LPG）只要其配比阀没有受到微泄漏的影响，则主要表现为总流量误差。在二元高压梯度系统上使用填料颗粒小于 2μm 的分离柱进行经典超高效液相色谱分离时，这些微泄漏在实践中几乎没有影响。如果色谱柱在最佳工作点甚至更高点运行，这种分离的总流速可达 2 ml/min，甚至更高。在这种情况下，要产生 90:10(v:v) 的流动相成分，则泵 A 的流速为 1.8 ml/min，而泵 B 的流速为 200 μl/min。由于入口或出口阀门的轻微泄漏，两个泵之一的泄漏率为 100 nl/min，因此会产生 0.006% 的流量误差（如果微泄漏发生在泵 A）或 0.05% 的流量误差（如果发生在泵 B），这完全不会影响色谱结果。然而，更具挑战性的液相色谱-质谱分离可能需要以 200 μl/min 的总流量运行，并从梯度组成开始，有时两种流动相中一种成分的含量会低于 1%。在这种情况下，如果在泵 B 的入口阀门处出现 500 nl/min 的过高泄漏率，例如由于未充分净化的溶剂颗粒进入泵内，则 B 的流量误差已经达到 25%，这意味着泵实际上输送的流动相成分不是 99:1 (v :v)，而是 99.25 : 0.75。

因此，不仅测得的保留时间与参考值有差异。由于与磨损有关的泄漏率会随时间而变化，因此不仅保留时间与参考值的系统偏移令人担忧，保留时间的稳定性也会受到漂移的负面影响。特别是反相色谱中的强极性分析物（通常只在有机相比例极低的情况下保留）以及蛋白质或肽对超高效液相色谱泵流量输送的微小波动非常敏感。超缓梯度斜率也是如此。有些蛋白质或肽类物质只需改变 0.1% B/min的流动相成分就能实现成功的色谱分离。

在我们的数字示例中，这意味着流动相的组成在 10 分钟内从 99 : 1 变为 98 : 2，这意味着两个泵头中每个泵头的流速变化为 200 nl/min2 ，总流量为 200 μl/min。由于单向阀密封不严或活塞密封件磨损，泵头中每增加一个数量级的微泄漏，都会对保留时间精度产生显著的负面影响。

与低压梯度泵相比，高压梯度泵由于其设计原理，受高压阀和密封件的微泄漏影响更大。然而，后者由于梯度延迟体积大等其他缺点，在 LCMS 分析中的应用非常有限，因此这里重点讨论二元 HPG。需要注意的是，如果错误仅发生在两个泵中的一个，则一系列色谱图的质量会受到更严重的影响。

简单地说：如果其中一个泵单向阀的泄漏率过高，而其他泵单向阀的微泄漏率非常接近，则会立即导致保留时间精度降低。如果所有阀门的微泄漏率相当接近，即使比通常情况下的泄漏率要大，保留时间的精度仍然会很高。只有相同型号的两个超高效液相色谱系统之间的时间比较才会显示出系统误差，因为一个系统的微泄漏率一致较高，会导致总流量减少，从而分别导致保留时间延后。

那么，应对这些挑战的技术解决方案是怎样的，才能在总流量较低的情况下，满足缓梯度斜坡和极端混合的苛刻要求，实现所需的保留时间精度呢？

事实上，有多种可行或不可行的方案可供选择。最简单的解决方案是：在超高效液相色谱系统的制造和装配过程中就尽可能排除微泄漏。遗憾的是，这在实践中并不可行。每个单向阀、每个活塞密封件在制造过程中都会因材料特性和制造工艺而产生一定的尺寸公差。从尺寸的角度来看，每分钟几十或几百纳升的泄漏率变化与表面不规则或球阀理想球形的偏差在几百纳米的范围内有关。如果只安装完美密封的部件，任何超高压液相色谱系统都将难以承受，因为阀门和密封件的生产浪费以及测量和测试工作都将是巨大的。

另一种方法是对阀门和密封件等关键部件进行严格、密集的测试工作和过程控制；然后在每个泵中只安装微泄漏程度相似的部件。这同样会导致制造成本增加，令人无法接受。与其将仪器制造精度提高到不经济的水平，还不如接受不可避免的微泄漏这一事实，并通过适当的超高效液相色谱泵和系统控制算法将泄漏的影响降至最低。

一种精细但合理且昂贵的设计方法是使用合适的传感器测量流体中的泄漏流量，并通过泵头中适当的流量输送修正来补偿由此产生的流量误差。一种相当简单、因此也很普遍的解决方案是，将泵工作活塞的位置与进样阀的进样时间同步，从一个 LC 分离到下一个 LC 分离。这种方法可确保泵在每次注入样品时始终处于相同的机械初始状态。从那时起，所有已知干扰都会对溶剂混合和总流量产生影响，从而在相同程度上影响色谱分离。因此，进样同步化并不会使泵的运行更精确，因为微泄漏造成的流量误差总和仍然存在；而只是泵现在总是产生相同的误差，且重现性显著提高，从而大大降低了保留时间的分散性。对于用户来说，这并没有什么不利之处，因为保留时间的准确性受更换分离柱或更换到另一个超高效液相色谱系统的影响更大。从质量和验证的角度来看，更重要的是保留时间的精密度，而这种进样同步化可大大提高保留时间的精密度。

总结

用高度优化的低扩散超高效液相色谱系统分析溶解在强溶剂中的样品时，可能会出现峰形或保留时间不稳定的问题，尤其是对于早期洗脱的化合物。在分离柱前增加混合体积会有所帮助。质谱仪可从高精度超高效液相色谱设备中获益，由于保留时间精度更高，分段 MRM (SRM) 模式下的数据点数量也更多。

超高效液相色谱泵中无处不在的微泄漏可能会对保留时间精度产生明显影响，尤其是在超高效液相色谱-质谱分离中。通过定期系统维护、使用高纯度溶剂以及先进的泵控制机制，可以最大限度地减少这种影响。

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