主题：【分享】【金秋计划】技巧与窍门：提高 LC-MS 的灵敏度

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发表于：2024/09/11 23:08:26 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

引言
通过 HPLC-MS（高效液相色谱-质谱联用技术）进行任何高灵敏度分析的前提条件是：使用超纯溶剂和试剂，并谨慎处理所有相关材料、耗材和系统。这样就能在从制备到质谱检测的整个样品处理过程中防止任何污染，并提高灵敏度。

下文将介绍各种措施和方法，以最大限度地提高 LC-MS 灵敏度和低检测限 (LOD)。每一个小窍门都能避免造成信号抑制、加合物形成、背景噪声升高和谱图复杂性增加的污染。

溶剂和添加剂 - 概述
LC-MS 中使用的典型溶剂包括水、乙腈、甲醇、异丙醇和正丙醇。酸（如甲酸）、碱（如氨）或缓冲剂（如醋酸铵）等添加剂可用于使分析物质子化或去质子化。

上述溶剂和添加剂的质量对 MS 检测灵敏度有很大影响；因此，必须使用 MS 级溶剂和超纯添加剂。请确保这些试剂在生产商处标注为 LC-MS 级。

一般来说，用于 HPLC 的有机溶剂（如乙腈和甲醇）有三种质量：等度级、梯度级和用于 LC-MS LiChrosolv® 的超纯级。对于 MS 分析，应使用超纯级质量溶剂，以确保最佳性能和可靠结果。

关于水，瓶装水或来自净水系统的 Milli-Q® 超纯水都适用于 MS 仪器。在用水量较低的情况下，最好使用瓶装水，而在用水量较高的环境下，则建议使用 Milli-Q® 水。Milli-Q® 系统提供 I 类水，与 LC-MS 分析完美匹配。应定期使用/冲洗，以保持甚至进一步改善水质。

缓冲液用于设置和控制特定色谱分离的 pH 值，并使溶液中的分析物质子化或去质子化，从而支持电喷雾电离过程。对于 LC-MS，只能使用挥发性缓冲液和添加剂，如甲酸铵或乙酸铵或三乙胺。使用非挥发性缓冲液（如硫酸盐、磷酸盐、硼酸盐）会导致质谱源沉淀，最终导致繁琐的清洗程序。缓冲液浓度过高可能会导致信号抑制。

缓冲剂可使分析分子 M 电离，但有可能与铵、甲酸盐或醋酸盐等形成加合物，即[M+缓冲剂]。这会在质谱图中产生具有特定 m/z 值的额外信号，从而影响定量分析。因此，对于食物、体液或组织等高盐负荷样品，建议使用固相萃取 (SPE)（如 SupelTM-Select HLB 或 LiChrolut® 和 Supelclean® 滤芯）进行脱盐处理。

缓冲剂应通过滴定相应的酸和碱来制备，因为其纯度通常高于相关的盐。如果必须使用盐，则应在使用前对所使用的盐进行 MS 分析，以确定盐中是否存在污染物以及污染物的类型。

溶剂和添加剂中的杂质或污染物会积聚在固定相上，并在梯度运行中以鬼峰的形式洗脱出来（图 1）。当色谱柱在梯度运行前在高水性条件下进行平衡时，可能会出现这种情况。如果污染物的浓度和/或保留率较高，和/或梯度的起始条件为高水性，则甚至可能在未进行平衡的情况下出现鬼峰。为避免在梯度运行中出现鬼峰，应尽量缩短色谱柱平衡时间，冲洗体积不应超过十个色谱柱体积。

图 1. 高效液相色谱柱在平衡和梯度洗脱过程中污染物的累积情况；增塑剂峰用星号（*）标出。

仪器：Bruker Esquire 6000plus
流动相A：为水/乙腈 95/5 (v/v)+0.1%甲酸
流动相 B：乙腈+0.1%甲酸
梯度：0% B (t=0 min)--> 95% B (t=3 min)-->95% B (t=5 min)
流速：0.4 mL/min
柱温：25度
检测器：pos. ESI-MS (TICs)
样本：通过将塑料管浸入水性溶剂 A 而添加的增塑剂

应避免使用盐酸、硫酸或硝酸等强酸，因为它们容易与被分析物形成强离子对，从而使分析物不适合任何类型的电离。此外，其中一些强酸还具有不利的氧化特性。

许多实验室使用三氟乙酸（TFA）来与肽和蛋白质形成离子对，并改善后续的 HPLC 分离效果；然而，TFA 会在质谱检测过程中对分析物造成强烈的离子抑制，并可能污染质谱仪。如果必须使用反式脂肪酸，则应添加弱酸或异丙醇，以减少信号抑制效应。另外，二氟乙酸（DFA）也可降低信号抑制效应（与使用反式脂肪酸相比）。
溶剂和添加剂的储存和处理

溶剂应贮存在生产商提供的原装瓶中，可以是表面处理过的琥珀色玻璃瓶，也可以是硼硅玻璃瓶。建议根据具体需要调整瓶子的大小，因为应尽可能避免换瓶/转移到不同的容器中，以免造成污染。避免使用标准透明玻璃瓶或钠钙玻璃瓶。浸出碱和二氧化硅会与分析物形成加合物。

瓶子必须密封，并使用直接安装在溶剂瓶上的专业瓶盖、适配器和管道连接到 HPLC 系统。任何自制的溶液都可能造成溶剂或流动相的污染，并可能导致有机溶剂挥发到实验室的大气中。

避免使用塑料设备，如瓶子、漏斗、烧杯或手套，因为它们会溶解出增塑剂、抗静电剂、稳定剂或防滑剂等添加剂（图 2）。唯一的例外是生产商已对可浸出物和可萃取物进行检测的设备，如移液器吸头或注射器。

图 2.分别储存在聚丙烯瓶（A）和干净的琥珀色玻璃瓶（B）中的两种
Milli-Q® 水样品的质谱图（下），以及相同样品的 TIC 图（上）。

分析是通过将溶剂直接注入以正 ESI 模式运行的质谱仪进行的。
实验室设备

实验室设备和容器的清洁最简单的方法是在通风橱中蒸发，因为 MS 应用中使用的所有试剂都是高纯度的挥发性试剂。在观察到污染的情况下，有必要使用 MS 级溶剂进行冲洗，以正确清洁设备。

如果出于某种原因需要使用洗碗机，则必须在清洗后用 MS 级溶剂多次冲洗器皿。

HPLC 色谱柱
选择高效液相色谱柱的尺寸不仅要考虑样品量、检测技术和必要的负载能力等因素，还要考虑经济因素，如减少溶剂消耗。减小色谱柱内径 (i.d.)，同时相应调整进样量和流速，是提高特定分离灵敏度的简单方法。

在 LC-MS 运行中，色谱柱本身是一个可能且经常出现的污染源，但往往被忽视。许多硅胶键合相本身就容易因水解而导致键合/相裂解，主要是在酸性 pH 值（如 pH 值低于 2）时，这种现象被称为柱流失。

使用清洗方案有助于减少柱流失的负面影响。或者，在使用 MS 之前，色谱柱应进行多达十次从强水性到强有机性的梯度运行。

HPLC 系统
高效液相色谱系统本身的适当设置也有助于提高灵敏度。一个重要的参数是最大限度地减少死体积，即从进样器到检测器单元的所有系统部件的体积，但高效液相色谱柱的体积除外。过大的死体积会导致色谱峰变宽、拖尾或分裂，从而导致分离度变差、性能下降，进而降低灵敏度，无法检测到低含量的分析物。因此，所有系统部件（管路、接头、配件）的死体积都必须尽可能小。

每隔 1 至 2 个月或在溶剂从乙腈改为甲醇（或相反）后更换泵入口过滤器。这种维护可降低基线噪音，保护系统和色谱柱不受泵碎片的影响。

溶剂入口过滤器的流出物过滤网应使用不锈钢或 PEEK 材料，而不是玻璃。后者的清洁工作十分繁琐，因为缓冲残留物很难去除，而且硅和碱可能会从玻璃过滤器中浸出并形成加合物。
一般性建议

根据不同色谱问题的具体要求，可能需要使用从水性到有机的各种流动相成分。一般建议，LC-MS 中使用的流动相的水相比例应设定在 5% 至 80% 之间，这样才能无故障地工作并获得稳定的喷雾。
如果水相比例低于 5%，缓冲液可能会在流动相液和 HPLC 系统中沉淀。对策是使用合适的有机溶剂或降低流动相中的缓冲液浓度。分析前应检查缓冲液在所用溶剂（和梯度范围）中的溶解度。
水相比例超过 80% 可能会导致质谱喷雾不稳定。有几种方法可帮助保持 MS 喷雾器正常工作。

在液相色谱系统之后、质谱源之前的流动相中加入乙腈或甲醇等挥发性有机溶剂，降低流动相的表面张力。
通过分流或柱交换减少输送到质谱仪的流量。
调节离子源条件（提高干气温度或流量）。

为避免系统和流动相受到微生物污染以及固定相塌陷，流动相的含水量不应超过 95%。如果需要高比例水相，可在流动相中加入 0.05% 的叠氮化钠。另外，在待机前必须定期用有机溶剂（最好是异丙醇或甲醇）冲洗 HPLC 系统。切勿使用乙腈，因为乙腈会聚合并堵塞系统阀门。

结论
质谱法是一种强大的技术，可用于鉴定和定量复杂混合物中的分子。质谱分析的成功在很大程度上取决于能否在整个 LC-MS 工作流程中减少污染：从样品制备到设备清洁。这一过程中重要的第一步就是为 LC-MS 专门使用最高质量的材料，包括溶剂、缓冲液、试剂和色谱柱。超纯溶剂和试剂与无污染处理相结合，确保了 LC-MS 灵敏度最大化和低 LODs

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