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主题：【第十七届原创】（琼脂）平板克隆斑实验

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Ins_564515b5
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发表于：2024/10/09 22:11:13 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
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一、概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

二、实验步骤：

1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。

2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每孔50、100、200个细胞的梯度密度分别接种于含2mL的培养液的6孔板中，并轻轻摇晃，使细胞分散均匀。（若细胞贴壁性好，增殖过程中不会生成部分悬浮细胞，可直接到步骤4）

3、待37℃孵育2h后，镜下可观察到细胞已经悉数贴壁，此时将6孔板中培养基换做含0.2% agar 的完全培养液。

4、置于培养箱中培养10-14天。(注意: 细胞培养时间视细胞而定,生长缓慢的细胞,可以适当延长培养天数.)

5、经常观察，当6孔板中出现肉眼可见的克隆时，一般为14天左右,最少不能低于10天，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次(可沿着侧壁缓慢加入,避免吹掉细胞)。加5mL冰甲醇固定细胞20分钟。然后去固定液，PBS小心浸洗1次，再加2ml苏木素染色5分钟，然后用流水缓慢洗去苏木素，空气干燥。

6、将6孔板倒置，并用记号笔在地面画出九宫格网格，用肉眼直接计数克隆球，或在显微镜（低倍镜）计数大于50个细胞的克隆球数。最后计算克隆形成率。

克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%

注意事项:

1.平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2.克隆球计数时,要求每个克隆球之间有一定的间隔,每个克隆球要求为明显独立的克隆球。

附:含0.2%agar 培养液配制：

1、琼脂准备：50ml超纯水于三角瓶（已消毒）内溶解0.5g琼脂粉(1%琼脂溶液)，置于微波炉中加热，约2min可完全溶解，注意防止琼脂溢出；

2、用温度计测量琼脂溶液的温度，至40℃左右，6孔板每孔按1.6ml 培养基+400ul 琼脂溶液的比例添加（琼脂浓度0.2%），漩涡震荡仪快速震荡后将孔内培养基换成含0.2% agar的培养基。为防止琼脂凝固，整个过程要快。
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