主题：【原创】我国从美加进口冷冻肉类检出兽药残留及其应对!

目前在加拿大、美国等莱克的添加时间大概在生猪出栏前的2-3周，虽然停药后残留少，但如果不停药或有污染的饲料，还是能检查到的。需要加强检查，保护食品安全。广东关口做得好。上海据说也查出有问题猪肉，按不许入关处理了。

中华人民共和国最高人民法院公告
《最高人民法院、最高人民检察院关于办理非法生产、销售、使用禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品等刑事案件具体应用法律若干问题的解释》已经最高人民法院审判委员会第1237次会议、最高人民检察院第九届检察委员会第109次会议通过。现予公布，自2002年8月23日起施行。二○○二年八月十六日

为依法惩治非法生产、销售、使用盐酸克仑特罗（Clenbuterol Hydrochloride 俗称“瘦肉精”）等禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品等犯罪活动，维护社会主义市场经济秩序，保护公民身体健康，根据刑法有关规定，现就办理这类刑事案件具体应用法律的若干问题解释如下：

第一条 未取得药品生产、经营许可证件和批准文号，非法生产、销售盐酸克仑特罗等禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品，扰乱药品市场秩序，情节严重的，依照刑法第二百二十五条第（一）项的规定，以非法经营罪追究刑事责任。

第二条 在生产、销售的饲料中添加盐酸克仑特罗等禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品，或者销售明知是添加有该类药品的饲料，情节严重的，依照刑法第二百二十五条第（四）项的规定，以非法经营罪追究刑事责任。

第三条 使用盐酸克仑特罗等禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品或者含有该类药品的饲料养殖供人食用的动物，或者销售明知是使用该类药品或者含有该类药品的饲料养殖的供人食用的动物的，依照刑法第一百四十四条的规定，以生产、销售有毒、有害食品罪追究刑事责任。

第四条 明知是使用盐酸克仑特罗等禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品或者含有该类药品的饲料养殖的供人食用的动物，而提供屠宰等加工服务，或者销售其制品的，依照刑法第一百四十四条的规定，以生产、销售有毒、有害食品罪追究刑事责任。

第五条 实施本解释规定的行为，同时触犯刑法规定的两种以上犯罪的，依照处罚较重的规定追究刑事责任。

第六条 禁止在饲料和动物饮用水中使用的药品，依照国家有关部门公告的禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录确定。

（附：农业部、卫生部、国家药品监督管理局公告的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》）

农业部、卫生部、国家药品监督管理局公告的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》

一、肾上腺素受体激动剂

1．盐酸克仑特罗（Clenbuterol Hydrochloride）：中华人民共和国药典（以下简称药典）2000年二部P605。β2肾上腺素受体激动药。

2．沙丁胺醇（Salbutamol）：药典2000年二部P316。β2肾上腺素受体激动药。

3．硫酸沙丁胺醇（Salbutamol Sulfate）：药典2000年二部P870。β2肾上腺素受体激动药。

4．莱克多巴胺（Ractopamine）：一种β兴奋剂，美国食品和药物管理局（FDA）已批准，中国未批准。

5．盐酴多巴胺（Dopamine Hydrochloride）：药典2000年二部P591。多巴胺受体激动药。

6．西巴特罗（Cimaterol）：美国氰胺公司开发的产品，一种β兴奋剂，FDA未批准。

7．硫酸特布他林（Terbutaline Sulfate）：药典2000年二部P890。β2肾上腺受体激动药。

二、性激素

8．己烯雌酚（Diethylstibestrol：药典2000年二部P42。雌激素类药。

9．雌二醇Estradiol　：药典2000年二部P1005。雌激素类药。

10．戊酸雌二醇Estradiol Valerate：药典2000年二部P124。雌激素类药。

11．苯甲酸雌二醇Estradiol Benzoate：药典2000年二部P369。雌激素类药。中华人民共和国兽药典（以下简称兽药典）2000年版一部P109。雌激素类药。用于发情不明显动物的催情及胎衣滞留、死胎的排除。

12．氯烯雌醚Chlorotrianisene药典2000年二部P919。

13．炔诺醇Ethinylestradiol药典2000年二部P422。

14．炔诺醚Quinestrol药典2000年二部P424。

15．醋酸氯地孕酮Chlormadinone acetate药典2000年二部P1037。

16．左炔诺孕酮Levonorgestrel药典2000年二部P107。

17．炔诺酮Norethisterone药典2000年二部P420。

18．绒毛膜促性腺激素（绒促性素）Chorionic Gonadotrophin：药典2000年二部P534。促性腺激素药。兽药典2000年版一部P146。激素类药。用于性功能障碍、习惯性流产及卵巢囊肿等。

19．促卵泡生长激素（尿促性素主要含卵泡刺激FSHT和黄体生成素LH）Menotropins：药典2000年二部P321。促性腺激素类药。

三、蛋白同化激素

20．碘化酪蛋白Iodinated Casein：蛋白同化激素类，为甲状腺素的前驱物质，具有类似甲状腺素的生理作用。

21．苯丙酸诺龙及苯丙酸诺龙注射液Nandrolone phenylpropionate药典2000年二部P365。

四、精神药品

22．（盐酸）氯丙嗪Chlorpromazine Hydrochloride：药典2000年二部P676。抗精神病药。兽药典2000年版一部P177。镇静药。用于强化麻醉以及使动物安静等。

23．盐酸异丙嗪Promethazine Hydrochloride：药典2000年二部P602。抗组胺药。兽药典2000年版一部P164。抗组胺药。用于变态反应性疾病，如荨麻疹、血清病等。

24．安定（地西泮）Diazepam：药典2000年二部P214。抗焦虑药、抗惊厥药。兽药典2000年版一部P61。镇静药、抗惊厥药。

25．苯巴比妥Phenobarbital：药典2000年二部P362。镇静催眠药、抗惊厥药。兽药典2000年版一部P103。巴比妥类药。缓解脑炎、破伤风、士的宁中毒所致的惊厥。

26．苯巴比妥钠Phenobarbital Sodium。兽药典2000年版一部P105。巴比妥类药。缓解脑炎、破伤风、士的宁中毒所致的惊厥。

27．巴比妥Barbital：兽药典2000年版一部P27。中枢抑制和增强解热镇痛。

28．异戊巴比妥Amobarbital：药典2000年二部P252。催眠药、抗惊厥药。

29．异戊巴比妥钠Amobarbital Sodium：兽药典2000年版一部P82。巴比妥类药。用于小动物的镇静、抗惊厥和麻醉。

30．利血平Reserpine：药典2000年二部P304。抗高血压药。

31．艾司唑仑Estazolam。

32．甲丙氨脂Meprobamate。

33．咪达唑仑Midazolam。

34．硝西泮Nitrazepam。

35．奥沙西泮Oxazepam。

36．匹莫林Pemoline。

37．三唑仑Triazolam。

38．唑吡旦Zolpidem。

39．其他国家管制的精神药品。

五、各种抗生素滤渣

40．抗生素滤渣：该类物质是抗生素类产品生产过程中产生的工业三废，因含有微量抗生素成份，在饲料和饲养过程中使用后对动物有一定的促生长作用。但对养殖业的危害很大，一是容易引起耐药性，二是由于未做安全性试验，存在各种安全隐患。

饲料中莱克多巴胺的HPLC法测定


摘 要 用碱性甲醇提取试样中的莱克多巴胺，经SLA固相萃取柱净化，浓缩后用2％乙酸溶液定容，过膜后用高效液相色谱－荧光检测法分离测定；色谱柱类型Waters Symmetry C18柱，250mm×4.6mm（i.d.），粒径5μm；流动相为戊烷磺酸钠溶液∶乙腈(体积比80∶20)；激发波长为226nm，发射波长为306nm；流速1ml／min；进样量50μl；饲料中莱克多巴胺的检测限为0.5mg/kg；莱克多巴胺的测定在0.02～0.50μg／ml范围内具有良好的线性关系，平均回收率在85.1％以上，RSD小于7.5％；方法简单，灵敏度高，可用于饲料中莱克多巴胺的含量测定。
　　关键词 莱克多巴胺； 残留； 饲料；高效液相色谱法
   
　　莱克多巴胺是苯乙醇胺类β2－肾上腺素兴奋剂，能促进动物体蛋白质沉积，抑制脂肪沉积，具有营养“再分配效应”[1,2]。因此，有人用来作为饲料添加剂，提高猪酮体的瘦肉率。但是，动物在饲用含莱克多巴胺的饲料后，会造成肌肉及组织中不同程度的残留，使用不当将导致消费者出现不同程度的中毒现象。为保障人民的身体健康和生命安全，保障畜牧业的健康持续发展，我国已经明确将其列入禁用药品目录。然而，在饲料或饲养过程中违法使用莱克多巴胺的现象已经出现，并有蔓延之势。
    由于莱克多巴胺是一种新型的β2－肾上腺素兴奋剂，目前的检测方法和检测标准很少[3,4]，特别是国内尚未见文献报道。因此探索饲料中莱克多巴胺的检测方法具有很重要的意义。我们比较了提取剂、提取方法、固相萃取柱、萃取试剂、流动相对提取效果的影响，在此基础上对HPLC测定方法进行了系统考察，即线性范围、重复性试验、稳定性试验、加标回收率等，最终确定了一套比较理想的检测条件。

1 实验部分

　　1.1 仪器与试剂
　　Waters 2695高效液相色谱仪；Waters W-474荧光检测器；PE LS-45型荧光分光光度计；KQ-500超声波振荡器；Sigma 2k15冷冻离心机；BüCHI B-490旋转蒸发仪；MS2 minishaker漩涡混匀器；METTLER AG-285电子天平；氮吹仪；SLA固相萃取柱（500mg/5ml），杭州富裕科技服务有限公司提供。
　　莱克多巴胺对照品；高效液相用乙腈为色谱纯，美国TEDIA；水为超纯水；戊烷磺酸钠为色谱级；其它试剂均为分析纯。
　　1.2 色谱条件
　　色谱柱类型Waters Symmetry C18柱，4.6mm×250 mm（i.d.），粒径5μm；流动相为戊烷磺酸钠溶液（取800ml水，加20ml冰醋酸和0.87g戊烷磺酸钠）∶乙腈(体积比80:20)；激发波长为226nm，发射波长为306nm；流速1ml／min；进样量50μl。
　　1.3 标准曲线的绘制
　　精密称取25mg莱克多巴胺对照品置于100ml棕色量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，为莱克多巴胺储备液。精密量取莱克多巴胺储备液1ml，置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得莱克多巴胺工作液。分别准确吸取一定量的标准工作液，用2％乙酸溶液稀释、定容，配制成浓度为0.02μg/ml、0.04μg/ml、0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml的标准溶液，分别进行HPLC检测。
　　1.4 样品提取与纯化
　　称取饲料3.0g，准确加入2％氨/甲醇溶液25ml，涡旋振荡1min，超声振荡10min，5 000r/min离心5min，取上清液10ml至鸡心瓶中，50℃旋转蒸干。用2mL甲醇和2ml正己烷溶解鸡心瓶，重复一次，弃去上层；再加入2ml正己烷，重复一次，分出甲醇至10ml离心管中，45℃氮气吹干。用5ml乙酸乙酯溶解，加少量无水硫酸钠，5 000r/min离心3min。洗涤液过SLA固相萃取柱（先经5ml乙酸乙酯润洗）用50％乙腈/乙酸乙酯溶液3ml洗涤柱子，然后用50％甲醇/乙酸乙酯溶液5ml洗脱收集，氮吹至干。用2％乙酸溶液定容到1ml，过膜，上机。

2 结果与讨论

　　2.1 色谱条件的优化
　　由于莱克多巴胺的紫外最大吸收波长在224nm左右，如果用此波长作为检测波长，则杂质干扰很大。由于莱克多巴胺具有荧光吸收，故我们采用荧光检测器进行检测。结果表明激发波长为226nm，发射波长为306nm时，吸收最强。流动相为戊烷磺酸钠溶液与乙腈经一定的配比而成，通过调整配比，流动相为戊烷磺酸钠溶液∶乙腈体积比为80∶20时，莱克多巴胺的保留时间比较适合，避免了杂质峰的干扰。
　　2.2 线性关系与线性范围
　　将绘制标准曲线用莱克多巴胺工作液按浓度从低到高，依次进行高效液相色谱分析。按其所得峰面积与对应的工作液浓度作标准曲线图，并计算回归方程和相关系数。莱克多巴胺浓度与峰面积的回归方程为：y=10 080 548x+6 438，相关系数r=0.999 9，在浓度0.02～1.0ug/ml的范围内线性关系良好，图1为莱克多巴胺的标准曲线图。

2.3 净化条件的确定
　　2.3.1 不同固相萃取柱的比较
　　用于β－兴奋剂净化的固相萃取柱有硅藻土、C8、C18、硅胶、强阳离子交换柱和弱阳离子交换柱等, 本文对SLA、SLH、C18、硅胶、胺基5种SPE净化柱进行除杂及过柱回收率比较，结果见表1（添加量为5.0mg/kg）。
　　经过以上效果比较，选择SLA型SPE净化柱作为饲料中莱克多巴胺测定净化柱，样品甲醇提取物经过SLA柱净化后，可以较好的达到净化目的，且过柱回收率在90%以上。

2.3.2 固相萃取条件的确定
　　选用2ml甲醇和2ml正己烷溶解鸡心瓶，弃去上层，利用正己烷的脂溶性除去部分杂质，收到了较好的效果。氮吹至干后用5ml乙酸乙酯溶解，加少量无水硫酸钠，除去微量水，洗涤液过SLA固相萃取柱。用50％乙腈/乙酸乙酯溶液洗涤柱子，当洗涤液为3ml时回收率较高，而且杂质干扰较少。然后用50％甲醇/乙酸乙酯溶液洗脱收集，先用洗脱液为5ml洗脱；另取5ml洗脱液重复一次，同法检测未发现莱克多巴胺，说明5ml可以将吸附在柱子上的莱克多巴胺完全洗脱下来。故理想的洗涤液用量为50％乙腈/乙酸乙酯溶液3ml，洗脱液用量为50％甲醇/乙酸乙酯溶液5ml。


图2是莱克多巴胺对照品、空白样品的、空白添加样品的高效液相色谱图。

2.4 重复性试验
　　对添加了0.5mg/kg、1.0mg/kg和5.0mg/kg莱克多巴胺的饲料进行重复试验。每个浓度取5份平行样，根据测定结果计算回收率和批内相对标准偏差，重复测定3次，计算批间相对标准偏差。
　　表2是莱克多巴胺添加量分别为0.5mg/kg、1.0mg/kg和5.0mg/kg的回收率结果列表。



　以上数据表明，莱克多巴胺添加量分别为0.05mg/kg、1.0mg/kg和5.0mg/kg时的回收率比较稳定。在5.0mg/kg的添加量时，批内相对变异系数5.0，批间相对变异系数≤10.0。而在添加量0.5mg/kg、1.0mg/kg时的回收率的批内相对变异系数≤10.0，批间相对变异系数≤10.0。为了保证本方法的有效性，确定本方法的实验室内平行测定间的变异系数不大于10％。

　　3 结论
　　
　　本方法准确地测定了饲料中违禁药物莱克多巴胺的含量。在本实验的色谱条件下，可以使被测样品中的各组分很好的分离开，出峰时间合适。通过本方法的建立，为打击不法分子使用莱克多巴胺提供了技术保证。

　　参考文献（略）