5 选用
液相色谱仪的注意事项
按照GB/T5009.29,流动相应为5:95的甲醇:0.02M醋酸铵溶液,但是这个比例仅是个参考值,我们在工作中应根据实际情况进行调节。
为什么用甲醇溶液?甲醇有两个作用,(1)防腐,
液相色谱柱最怕流动相长菌,尤其霉菌。甲醇可使蛋白质变性,有杀菌作用。(2)调节流动相极性,这是最重要的一点。甲醇在溶液中比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变,因此可以通过改变流动相中甲醇含量,以调节这几个组分的出峰和分离,以得到较理想的色谱图。
5:95是一个通用的比例,如减少甲醇含量,苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢,扩散效应增大,峰形较差,但这三组分的分离情况较好。如增加甲醇含量,苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间提前,扩散效应较小,峰形尖锐,但这三组分的分离情况可能受影响,产生重叠。在选择条件时,只能通过实验手段,如配制3:97,4:96,5:95,6:96,7:93的流动相,综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。
不同柱的最适比例不同,举例来说,色谱科公司的
液相柱最适比例为4:96,而岛津公司
液相柱的最佳比例为7:93。就是同一根柱,一年前和一年后的极性也会有变化,需调节溶液配比。
为什么使用0.02M醋酸铵溶液?加入醋酸铵是为了调节离子强度,使待测物的峰形不致于变坏。如果单独检测苯甲酸和糖精钠,加不加醋酸铵没有什么关系,都可以得到较好的峰形;但是检测山梨酸时流动相一定要加醋酸铵,否则得不到一个完整的色谱峰,峰形呈破裂状。
醋酸铵溶液浓度不需严格控制,0.01M、0.02M、0.04M均可。
苯甲酸、山梨酸、糖精钠在
液相上的出峰次序很有特点。在流动相5:95及以下比例时,次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠(注意一下
气相的出峰次序),逐步增大甲醇含量,苯甲酸、山梨酸的出峰时间逐步提前,而糖精钠是出峰时间迅速提前,随着甲醇比例的逐步增大(15%-30%),原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、山梨酸重叠,并位于最前面,其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇浓度,次序不变。
用高甲醇比例条件(甲醇15%以上)做出的三种标准物质色谱图峰形较好,出峰时间也较快,但做实际样品时干扰较大;因此建议尽量使用低甲醇比例条件(甲醇5%左右)。
6 苯甲酸、山梨酸超标时的判断
苯甲酸、山梨酸超标的样品较多,由于它们往往牵涉到一批货物是否合格,因此责任重大。由于该方法定量较准确,因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。
如同时有
气相色谱仪和
液相色谱仪,建议用这两种性质相差较大的仪器进行对照,如定量结果差不多,即可确认。
如只有
气相色谱仪,应利用其在填充柱保留时间稳定的特性,同时进五针标准液和五针样品液(注:峰面积应差不多,否则需对一方按比例稀释),如标准和样品液的保留时间相差时间超过1 秒,可认为不是。(如进针的技术不过关,请不要做此实验)
如用
液相色谱仪,当检测器为二极管阵列检测器时,根据保留时间和紫外吸收图结合定性,当只有紫外检测器时,改检测波长为220nm,230nm,250nm,重复进标准和样品液,由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。
如有微生物检测手段,可加样品于有菌培养基中,观察有无抑菌现象,如无抑菌现象则无防腐剂。
不是很推荐用双柱法,因为有时柱极性相差不大,反而会影响最终判断。
7 糖精钠超标时的判断
当检测糖精钠超标时,除了采用二极管阵列检测器或波长验证,还可以利用糖精钠的荧光特性,用荧光检测器进行验证。荧光条件是激发波长为277nm,荧光波长为410nm。只有当用荧光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多,才可以判断为是。
还有一个简单粗糙、却也行之有效的验证方法,即感官法。糖精钠是一种甜味剂,用舌头可以感觉到它的甜味,如果含量超标,一定能尝出来。
8 标准溶液的配制贮存问题
苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体,一般几个月后会严重降解,。如用甲醇溶解再放于冰箱冷冻层,可保持稳定一两年。因此推荐用甲醇作溶剂。
在配制标准溶液时,初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠,用水溶解苯甲酸,晃了半天才发现怎么也不没溶解。应该用弱碱性水溶解苯甲酸钠、山梨酸钾,用甲醇溶解苯甲酸、山梨酸。
9 苯甲酸、山梨酸的应用范围
首先应注意到,并不是所有食品都需要加入防腐剂,只有那些富含营养物质,且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要,否则对厂家来说会增加不必要的成本。
酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于开封后不可能短期内吃完,月饼等需在货架上摆放,如不加防腐剂很快会发霉变质,有添加防腐剂的必要。而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用完毕,即在细菌大量繁殖前己被消化了,因而没有添加的必要。
苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用,含量就不能太低。如果我们检测样品时只有几个ppm的浓度,有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的,而不是厂家出于防腐目的加入的。
苯甲酸、山梨酸也只是防腐剂中的两种。并不是所有需要加入防腐剂的食品都会添加苯甲酸、山梨酸,有可能使用防霉剂或其它种类的防腐剂,或自行规定需冷藏(如某些月饼)。因此有些食品检测不出也属正常。
另外,我们应该比较清楚地理解苯甲酸与苯甲酸钠、山梨酸与山梨酸钾之间的关系。在食品中添加防腐剂通常以苯甲酸钠、山梨酸钾形式加入,它们不易汽化,易溶于水,但不溶于甲醇等有机试剂;而苯甲酸、山梨酸易汽化,易溶于有机试剂,但是几乎不溶于水。检测时要注意有机酸及其盐类之间的转换。