4. 荧光显微镜
荧光显微镜是用短波长的光线照射用荧光素染色过的被检物体,使之受激发后而产生长波长的荧光,然后观察。荧光显微镜广泛应用于生物,医学等领域。
(1) 荧光显微镜一般分为透射和落射式两种类型。
a. 透射式:激发光来自被检物体的下方,聚光镜为暗视野聚光镜,使激发光不进入物镜,而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮,而高倍则暗,在油浸和调中时,较难操作,尤以低倍的照明范围难于确定,但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。
b. 落射式:透射式目前几乎被淘汰,新型的荧光显微镜多为落射式,光源来自被检物体的上方,在光路中具有分光镜,所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用,不仅便于操作,而且从低倍到高倍,可以实现整个视场的均匀照明。
(2) 荧光镜检术的注意事项
a. 激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象,因此尽可能缩短观察时间,暂时不观察时,应用挡板遮盖激发光。
b. 作油镜观察时,应用"无荧光油"。
c. 荧光几乎都较弱,应在较暗的室内进行。
d. 电源最好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。
目前许多新兴生物研究领域应用到荧光显微镜,如基因原位杂交(FISH)等等。
5. 相衬显微镜(Phase contrast microscope)
在光学显微镜的发展过程中,相衬镜检术的发明成功,是近代显微镜技术中的重要成就。我们知道,人眼只能区分光波的波长(颜色)和振幅(亮度),对于无色通明的生物标本,当光线通过时,波长和振幅变化不大,在明场观察时很难观察到标本。
相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检,也就是有效地利用光的干涉现象,将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差,即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察,因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜中。
相衬镜检法在装置上与明场不同,有一些特殊要求:
a. 环状光阑(Ring slit): 装在聚光镜的下方,而与聚光镜组合为一体---相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内,外面标有10X、20X、40X、100X等字样,与相对应倍数的物镜配合使用。
b. 相板(Phase plate): 装在物镜的后焦平面处,它分为两部分,一是通过直射光的部分,为半透明的环状,叫共轭面;另一是通过衍射光的部分,补偿面"。有相板的物镜称"相衬物镜",外壳上常有"Ph"字样。
相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法,想要得到好的观察效果,显微镜的调试非常重要。除此之外还应注意以下几个方面:
a. 光源要强,全部开启孔径光阑;
b. 使用滤色片,使光波近于单色。
6. 微分干涉对比显微镜(Differential interference contrast DIC)
微分干涉对比镜检术出现于60年代,它不仅能观察无色透明的物体,而且图象呈现出浮雕壮的立体感,并具有相衬镜检术所不能达到的某些优点,观察效果更为逼真。
(1) 原理
微分干涉对比镜检术是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等,光束分别在距离很近的两点上通过被检物体,在相位上略有差别。由于两光束的裂距极小,而不出现重影现象,使图象呈现出立体的三维感觉。
(2) 微分干涉对比镜检术所需的特殊部件:
a. 起偏镜
b. 检偏镜
c. 渥拉斯顿棱镜2 块
(3) 微分干涉对比镜检时的注意事项
a. 因微分干涉灵敏度高,制片表面不能有污物和灰尘。
b. 具有双折射性的物质,不能达到微分干涉对比镜检的效果。
c. 倒置显微镜应用微分干涉时,不能用塑料培养皿。
7. 倒置显微镜(Inverted microscope)
倒置显微镜是为了适应生物学、医学等领域中的组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验等显微观察。
由于上述样品特点的限制,被检物体均放置在培养皿(或培养瓶)中,这样就要求倒置显微镜的物镜和聚光镜的工作距离很长,能直接对培养皿中的被检物体进行显微观察和研究。因此,物镜、聚光镜和光源的位置都颠倒过来,故称为"倒置显微镜"。倒置显微镜多用于无色透明的活体观察。如果用户有特殊需要,也可以选配其它附件,用来完成微分干涉、荧光及简易偏光等观察。
目见倒置显微镜广泛应用于patch-clamp ,transgene ICSI 等领域。
8. 数码显微镜
数码显微镜是以摄像头(即电视摄像靶或电荷耦合器)作为接收元件的显微镜。在显微镜的实像面处装入摄像头取代人眼作为接收器,通过这种光电器件把光学图像转换成电信号的图像,然后对之进行尺寸检测、颗粒计数等工作。这类显微镜可以与计算机联用,这便于实现检测和信息处理的自动化,多应用于需要进行大量繁琐检测工作的场合。
光学显微镜的使用规程
(一) 实验时要把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置,镜座应距桌沿 6~7 cm左右。
(二) 打开光源开关,调节光强到合适大小。
(三) 转动物镜转换器,使低倍镜头正对载物台上的通光孔。先把镜头调节至距载物台1~2cm左右处,然后用左眼注视目镜内,接着调节聚光器的高度,把孔径光阑调至最大,使光线通过聚光器入射到镜筒内,这时视野内呈明亮的状态。
(四) 将所要观察的玻片放在载物台上,使玻片中被观察的部分位于通光孔的正中央,然后用标本夹夹好载玻片。
(五)先用低倍镜观察(物镜10X、目镜10x)。观察之前,先转动粗动调焦手轮,使载物台上升,物镜逐渐接近式样。然后,左眼注视目镜内,同时右眼不要闭合(要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯,以便在观察的同时能用右眼看着绘图),并转动粗动调焦手轮,使载物台慢慢下降,不久即可看到玻片中材料的放大物像。
(六) 如果在视野内看到的物像不符合实验要求(物像偏离视野),可慢慢调节载物台移动手柄。调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰,可以调节微动调焦手轮,直至物像清晰为止。
(七)如果进一步使用高倍物镜观察,应在转换高倍物镜之前,把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时,视野中的物像范围缩小了很多)。一般具有正常功能的显微镜,低倍物镜和高倍物镜基本齐焦,在用低倍物镜观察清晰时,换高倍物镜应可以见到物像,但物像不一定很清晰,可以转动微动调焦手轮进行调节。
(八) 在转换高倍物镜并且看清物像之后,可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低,使光线符合要求(一般将低倍物镜换成高倍物镜观察时,视野要稍变暗一些,所以需要调节光线强弱)。
(九) 观察完毕,应先将物镜镜头从通光孔处移开,然后将孔径光阑调至最大,再将载物台缓缓落下,并检查零件有无损伤(特别要注意检查物镜是否沾水沾油,如沾了水或油要用镜头纸擦净),检查处理完毕后即可装箱。
七、 光学显微镜的维护
(一) 必须熟练掌握并严格执行使用规程。
(二) 取送显微镜时一定要一手握住弯臂,另一手托住底座。显微镜不能倾斜,以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。
(三) 观察时,不能随便移动显微镜的位置。
(四) 凡是显微镜的光学部分,只能用特殊的擦镜头纸与溶液一同擦拭,不能乱用他物擦拭,更不能用手指触摸透镜,以免汗液玷污透镜。
(五) 保持显微镜的干燥、清洁,避免灰尘、水及化学试剂的玷污。
(六) 转换物镜镜头时,不要搬动物镜镜头,只能转动转换器。现在显微镜有电动转换,这点比较好,使用也很方便.是一个发展方向.
(七) 切勿随意转动调焦手轮。使用微动调焦旋钮时,用力要轻,转动要慢,转不动时不要硬转。
(八) 不得任意拆卸显微镜上的零件,严禁随意拆卸物镜镜头,以免损伤转换器螺口,或螺口松动后使低高倍物镜转换时不齐焦。
(九) 使用高倍物镜时,勿用粗动调焦手轮调节焦距,以免移动距离过大,损伤物镜和玻片。
(十) 用毕将光源调到最小,这样对灯泡的使用寿命很有帮助!