透析和在线HPLC测定禽肉中硝基咪唑类和硝基呋喃类药物的残留量(EEC,Sg3.2筛选法)Analysis with Dialysis and On-line HPLC for Determining Residues
of Nitromidazoles and Nitrofurans in Poultry
(chickens, ducks and turkeys) Meat
(EEC,Sg3.4 Screening Method)
安全操作注意事项及急救:
安全
有机试剂:所有的有机试剂必须作为潜在的危险品处理,并且所有使用步骤必须在通风橱中操作。
引言
硝基咪唑类药物(本文指二甲硝嘧唑和甲硝咪乙酰胺)是使用于家禽的抗球虫剂。二硝基咪唑的最大残留限量(MRL)是10μg/kg;甲硝咪乙酰胺的最大残留限量(MRL)是2μg/kg,此两种硝基咪唑类药物具有共同的代谢产物:1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑。硝基呋喃类药物(本文指呋喃唑酮和呋喃它酮)是用于猪和家禽的抗菌剂。
1. 主题内容
本工作依照残留指令(86/469/EEC)执行。
2. 应用范围
本方法用于测定家禽肉中的二甲硝咪唑,甲硝咪乙酰胺以及它们共同的代谢产物1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑。该方法也包括禽肉中呋喃唑酮和呋喃它酮的监测。本方法作为一种常规监控方法,对于硝基咪唑类和1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑和呋喃唑酮的检测限是2μg/kg,对于呋喃它酮,其检测限为4μg/kg。
3. 参考文献
93/256/EEC委员会指令,规定测定具有激素和甲状腺拮抗作用的物质残留的方法,[OJ.NL.118 ,14.4.93.pp64-74]
ISO标准78/2-1982对标准进行设计—第二部分:化学分析标准
ISO标准5725(1986)
Aerts,M.M.L,Beek,W.M.J. and Brinkman,U.A. Th.,(1990),J.Chromatogr.500,453~468
Elema,M.C.,Beek,W.M.J. and Keuken,H.J(1992),CF-LC. RIKILT-DLO,SOP N’ AO656. RIKILT,Wageningen,NL.
Kenkens,H.J.,Elema,M.C. Beek, W.M.J. and Boekestein,A.(1993) Proc.Euroresidues Ⅱ May 1993,PP 410-414.
4. 定义
硝基咪唑类和硝基呋喃类含量是指按照所描述的方法检测肉中含有的硝基咪唑类和硝基呋喃类药物的量,表示为μg/kg。
5. 原理
该方法所有的操作需在暗处避光操作,且由四个步骤组成:
—肉在水中均质
—离心
—用透析法对提取物上清液进行净化
—用配有UV的HPLC在320nm进行定量测定
6. 材料
6.1 化学试剂
6.1.1 甲醇:分析纯
6.1.2 乙腈:HPLC级
6.1.3 无水醋酸钠
6.1.4 冰醋酸
6.1.5 软化水:用Milli-Q净化系统纯化(Millipore,Milford,USA)
6.2 溶液
6.2.1 0.01mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液,pH4.3。在约800mL水中溶解0.82g无水醋酸钠(6.1.3),用冰醋酸(6.1.4)调节pH值到4.3,用水稀释到1L。
6.2.2 HPLC洗脱液,用850mL醋酸缓冲液(6.2.1)与150mL乙腈(6.1.2)混合,通过0.22μm的微孔滤膜过滤,并用超声水浴脱气。该溶液在一月内稳定。
6.3 标准溶液
6.3.1 二甲硝基咪唑和甲硝咪乙酰胺(),1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑,由Merck公司,Shark和Dohme赠送。呋喃唑酮和呋喃它酮从美国公司获得。
6.3.2 标准贮备液:在甲醇溶液中配制浓度为100μg/mL的硝基咪唑类和硝基呋喃类药物以及1-甲基-2-羟甲基-5-硝基咪唑标准溶液作为标准贮备液,该溶液在暗处4-8℃可保存1个月。
6.3.3 稀释标准液:精密吸取1mL标准贮备液(6.3.2)于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
6.3.4 标准工作液: A(5ng/mL);精吸0.5mL 6.3.3溶液于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。B(20ng/mL);精吸2mL 6.3.3溶液于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
7. 仪器设备
7.1 玻璃器皿
7.1.1 刻度吸管
7.1.2 玻璃离心管
7.1.3 6mL玻璃试管
7.1.4 100mL容量瓶
7.1.5 常备实验室玻璃器皿
7.2 仪器
7.2.1 自动移液管
7.2.2 分析天平
7.2.3 冷冻离心机
7.2.4 冰箱:<-18℃
7.2.5 振动混合器
7.2.6 均质器:400型Stomacher实验室混合器。
7.2.7 滤纸(Schleicher & Schuell 5951/2; 15cm)
7.2.8 pH计
7.2.9 洗脱液过滤系统;0.22μm.(Millipore 83813)
7.3 透析装置(见示意图)
自动进样器—透析模块系统由一个232-401型自动进样器,两个自动六孔阀(Rheodyne 7010型),一个401型二级稀释器,一个Kel-F装配了CupropHan模(阻断10000-15000道尔顿)的平板透析器支架,具有370μL的供给体积和650μL的接受体积,一个能保持恒定无脉冲的流量为每分钟0.1-2mL的
液相色谱泵(305型,Gilson)组成。稀释器装配了2支 5mL注射器。进样装置的样器盘必须被冷却到4℃,并保持试验样品为4℃。
Auto.
Sampl.
D10
Dial.
Pump
W
W
透析和HPLC系统的示意图
7.4 HPLC仪器
基础系统:Gilson 305和805
保护柱:Bondapack / Corasil 37-50um,10mm×2.1mm内径(Millipore 27248)
分析柱:Lichrosorb C-18, 5μm,200mm×3.0mm内径
记录仪:10mV,0.5cm/min(Kipp BD-41)
检测器:UV 320nm,0.002Aufs,Rise time 2 sec.(ABI 785A型)
流量:0.4mL/min
8.样品和取样程序
注意事项见6.3.1节和ISO文件78/2-1982,下列注意事项由2052/VI/84-EN的附录Ⅱ导出:
8.1 样品性质:肉、奶和蛋的样品应能够进行残留检测,只有样品在不被微生物腐败的情况下才可被检测。
8.2 样品体积:样品体积必须足够大,以便执行参考方法,并在需要时可进行重复分析。
8.3 样品收集后,必须冷冻保存在≤-20℃。