样品在色谱柱内的情况,我们可以打个比方,大家都看过电影节走红地毯的明星们吧,把色谱柱看成红地毯,然后一群明星(样品)要走过红地毯,地毯旁边会有一大群的记者和影迷,他们就是色谱柱的填料,假设治安状况不够好,明星都需要带着保镖过地毯,保镖我们认为是推着样品前进的流动相,由举办电影节的我们雇佣使用。我们的目的,就是把不同影片的明星分开来,地毯旁的记者影迷(色谱柱填料),负责跟明星握手合影等,这样人气旺的行进速度就会慢,没人搭理的明星们就走的快,在地毯那头,我们的目的达到,明星们分开了。我要开始理论解释了(汗一个先),我们是电影节的组织者,我们要知道那些明星收了出场费但是人没来,所以必须点清明星的个数。在这个过程中,保镖(流动相)是我们雇佣的,有什么问题优先找他们,影迷(色谱柱)是其次可以下手的,明星(样品)我们得罪不起,一般不考虑改变他们来达到目的。就跟踢球踢不过人家,你可以买球员请教练,但是你不能换对手一样;我们对样品没有选择权。给你什么你就得做什么。
合适的检测方法要保证:
第一,保镖不要对明星太客气,让他们一拥而上过去握手拍照,队形就会拉的很长很散,也许来自同一部影片的明星们都要被分成两队了,这严重影响我们数人头,所以不允许。(流动相的pH和样品的Pka不能接近,否则会出现很难看的峰型,有时甚至出现分叉峰。)
第二,保镖们不要太凶悍,或者明星不要太冷门,这样两边的影迷记者没机会或没兴趣跟明星亲密接触,哗啦啦冲过去了,我们的目的没达到,不行。(选择的色谱柱的固定相要对样品有一定保留,不然样品一下过去,没有任何保留直接出峰,这样的条件是不可行的,因为色谱柱没起到作用,样品里面的东西完全没分离。)
这样的情况下,我们首选考虑换一批不那么凶的保镖(调整流动相的极性,或是降低有机相的比例一般可以改善出峰太早的情况);还有些明星们心急一下子冲过去,这么不给面子的,一定要保镖拦着,保持队形通过(抑制扩散快的样品需要极性强于他的流动相,很多酸性稍强的有机酸,如果水相不加其他东西只是纯水,就会不出峰——因为混在人群中过去了你没看到——或出峰很快,选择比它强的酸是很常见的做法);最后,我们不能怪明星们名气太低,人都是你请的啊,没办法,换一批对他们感冒的粉丝站两边吧。(样品就那样,我们不能改变,如果你使用了你认为合适的流动相体系,样品还是在2分钟或更早就出来,那建议考虑换跟柱子。有些极性特别明显的样品,氰基柱或氨基柱都是不错的选择,或者他们刚好有CN或NH2的基团,这样效果最明显)
第三,跟上面相反,明星太受欢迎,半天移动不了几步,这样我们要调整保镖,拉开旁边太狂热的粉丝们,冲过去。(保留时间太长,出峰太慢的时候,别犹豫,不改变分离的情况下加大有机相比例吧,出峰晚对柱效影响也很大)
第四,某几个明星人
气相差很小,影迷对他们的喜欢不相伯仲,于是合伙过地毯——不行(某几个峰不能分离的情况。)
这种情况有以下几种解决方法,大家众所周知的,降低有机相比例可以改变出峰时间,这是首选方法。需要补充一点的是,降低了有机相的比例,只会使所有的峰都后移——我知道有前移的,咱不说那个——但是如果本来分不开的两个峰,前峰的往后跑的多,后峰的往后跑的少,那么调整可能带来相反结果,两个离得更近了,这点要注意。改变缓冲盐的种类或加大缓冲盐的浓度有时也可以改变分离度,一般来说,这对于由峰型不好引起的分离不好作用明显一些。
其次,我们可以换一批更狂热的粉丝团——色谱柱。
狂热的粉丝们不比中庸的C18,看到脸熟都要去握个手,他们喜好明显(对于有苯环,杂环的样品,苯基柱会比C18好,有CN,NH2基团的样品,当然用对应的色谱柱了,C18和C8的差别选择也可以根据这个来判断)。
记住,我不是一上来就推荐你用C18以外的柱子,能用C18这样常用的柱子当然选择它了,不行才选其他的。
这里顺带简要介绍一下色谱柱。有位达人说,C18柱的分离,其实就是样品水溶性差异的分离。在大多数情况下,我认为这个道理成立。C18这么长的一个碳链,极性是非常小的,样品在流动相和色谱柱中间的分配,基本都取决于水溶性差异。但是,现实情况是,在一根C18柱上不能分离的两个峰,换一跟完全分离了,还很漂亮,这跟理论不一样啊。按我理解,这是因为现代色谱柱的特点引起,各个品牌的C18柱都有各自的封尾技术,就是在闲置的Si-OH上面搞,有的是在他们上面连了个CH3——甲基,有的是异丙基,有的干脆把两个Si-OH脱一个水连起来,也有搞包被技术隔离Si-OH的,这就使原本没极性的C18柱带上了C1,C3等等极性相对大很多的基团(好像还有上苯基的,非罗门好像有一款是C1-C6都加的有,还特别宣传过,不过不太确信,忘记了),这样一来,不同C18柱的分离差异相差就有了较大的区别。在某方面来说这是好事,但也会有其他的麻烦,新上的基团会对某些样品有特殊的分离作用,这个我们欢迎,但是新加上去基团的数量会严重影响样品的保留时间。你会看到有的色谱柱宣传他们对流动相比例的改变响应非常敏感,稍微改变比例就会引起分离度的较大差别,有的色谱柱则强调它们各个批次间的差异非常小,你知道原因了吧。对于开发检测条件,前者当然方便,对于长期固定方法检测,后者要好,大家各取所需即可。
最后,前面两种情况都无法改变,或者你觉得换色谱柱很麻烦,那么我们还有大招——让明星们自带粉丝团。这就是离子对试剂。有些样品往往会出现峰型很怪,馒头,山坡等,这是因为保镖和明星们关系不错,限制太少,没有让排成一列横队前进,而是放任他们跑前跑后跟影迷握手(样品的电解平衡点跟流动相很接近,出现了两种形态,离子态和分子态),这跟前面有个情况很相似,正常情况下我们可以用加强保镖力度的方法解决(使流动相的pH和样品的PKa相差2以上),但是遇到大牌明星,你管的太严,人家脸一黑,径直过了红地毯谁也不搭理,你没办法了吧(pH因为不能过7,只能往小了调,改的太低,会影响保留时间)。这个时候,只好请来明星们的铁杆粉丝团,簇拥他们过地毯,这样行进速度慢了下来,对外围的伪粉丝骂退,真粉丝或记者和里面铁杆都是熟人,大家该合影的合影,该打招呼的打招呼,保持了队形,还让不同的明星分离开来。问题解决。(离子对试剂和样品结合,然后色谱柱对其进行保留)这样做的坏处就是清场比较困难,明星都走半天了,铁杆还不愿意散去——你还是打落牙齿咽在肚子里面吧,谁让人家是大牌呢?(离子对试剂使用前,色谱柱需要稳定比较长的时间,运行后的清洗也需要比一般缓冲盐更长的时间,有的色谱柱宣传他们对离子对试剂稳定很快,可见他们是非常职业的记者粉丝团,为我们电影节的组织人员提供了方便。)
上面举例为了说明情况,是按照一般的色谱原理比喻的。其实我们常用的反相色谱,分离模式大多数时候刚好相反,也就是说,两边站的影迷不一定是来拍照合影,而是相当部分都拿着臭鸡蛋准备砸的,这个时候的分离不是看谁的人气高吸引力强出的晚,其实是看谁更不受欢迎谁就跑的更快。其实我觉得道理都一样,换个说法而已。
小贴士:有时候峰型很不好的时候,不一定非得加离子对试剂,添加少许更强的有机试剂如异丙醇,二氧六环等溶剂,会起到意想不到的效果,四氢呋喃也一样,但是要说明的是,这些东西不宜加的太多,尤其是二氧六环,整个体系内0.1%就算比较多了。不过不推荐太新的新手这样。