主题：【原创】紫外分光光度法测定灭菌乳中乳果糖的含量

摘要:对灭菌乳中乳果糖含量进行研究,初步探索了用紫外分光光度法对其进行测定的方法.牛奶在加热处理过程中, 部分乳糖异构为乳果糖, 经β-D- 半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖,通过酶转化为NADPH,确定其最大吸收波长为340nm,可在此波长下测出它的吸光度并计算出其质量浓度.结果表明:该方法灵敏度高,准确性好,适用于灭菌乳中乳果糖含量的测定。
关键词：紫外分光光度 灭菌乳  乳果糖
   
国务院办公厅《关于加强液态奶生产经营管理的通知》要求，完善液态奶标准并严格按标准组织生产 ，凡在灭菌乳 、酸牛乳等产品生产加工过程中使用复原乳的，不论数量多少 ，生产企业必须在其产品包装上醒目标注“复原乳”。农业部近发布的《巴氏杀菌乳和ＵＨＴ灭菌乳中复原乳的鉴 定》标准，为巴氏杀菌乳和ＵＨＴ灭菌乳中复原灭菌乳中复原乳的乳成分的检测提供了科学依据 。
  本实验采用紫外分光光度法对灭菌乳中乳果糖含量进行测定，并优化了试验方法，采用光谱扫描功能对最大吸收波长进行优化，并采用时间扫描功能监控酶的反应速率。确定在紫外光区340nm处测定乳果糖的方法，该方法灵敏度高，准确性好，对乳品中复原乳的监控起到积极作用。
1仪器和试剂
1.1    仪器和设备
1.1.1 UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津有限公司）
1.1.2 水浴或干燥箱: 温度能维持在40℃±2℃。
1.2    试剂
除非另有说明, 在分析中仅用分析纯试剂和GB/T 6682- 1992中一级水。
碳酸氢钠(NaHCO3)；过氧化氢(H2O2) , 质量分数为30%；辛醇(C8H18O)；灭菌水；300g.L-1硫酸锌溶液；150 g.L-1亚铁氰化钾溶液；0.33mol.L-1氢氧化钠溶液；1mol.L-1氢氧化钠溶液；缓冲液A: pH= 7.5称4.8 g 磷酸氢二钠, 0.86 g 磷酸二氢钠和0.1 g 硫酸镁溶解于80mL水中, 用1mol.L-1 氢氧化钠溶液调整pH 到7.5±0.1 ( 20℃) , 稀释到100mL , 摇匀；缓冲液B: pH= 7.6称取14.00g三乙醇胺和0.25g硫酸镁溶解于80mL水中。用1 mol.L-1氢氧化钠溶液调整pH到7.6±0.1( 20℃),稀释到100mL ,摇匀；缓冲液C将40.0mL缓冲液B 用水稀释到100mL ,摇匀；β-D- 半乳糖苷酶悬浮液用3.2 mol.L-1 硫酸铵溶液将活性为30 IU.mg-1 的β-D- 半乳糖苷酶制备成浓度为5mg.mL-1的悬浮液；葡萄糖氧化酶悬浮液；用灭菌水将活性为200 IU•mg-1 的葡萄糖氧化酶制备成浓度为20 mg.mL-1悬浮溶液；过氧化氢酶悬浮液：用灭菌水将活性为65000 IU.mg-1的过氧化氢酶制备成浓度为20 mg.mL-1的悬浮液；己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脱氢酶悬浮液(混酶)：在1mL浓度为3.2 mol. L-1硫酸铵溶液中加入2 mg 活性为140 IU.mg-1 的己糖激酶和1 mg 活性为140 IU.mg-1的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,轻摇均匀,成悬浮液；磷酸葡萄糖异构酶悬浮液
用3.2 mol. L-1硫酸铵溶液将活性为350 IU.mg-1的磷酸葡萄糖异构酶制备成浓度为2 mg.mL-1 的悬浮液； ATP 溶液将50 mg 5'-ATP-Na2 和50 mg 碳酸氢钠溶于1mL水中；NADP 溶液：将10mgβ-NADP-Na2溶于1mL水中。
2 试验方法
2.1 试液制备
量取50.0mL样品到100mL容量瓶中, 用水稀释到刻度后混匀。
2.2 纯化
吸取10.0mL试液于50mL锥形瓶中, 依次加入1.75mL亚铁氰化钾溶液、1.75mL硫酸锌溶液和6.5mL缓冲液A。每加入一种溶液后, 充分振荡均匀。全部溶液加完后, 静置10 min，过滤, 弃去最初的1mL～2mL滤液，收集滤液。
2.3 水解乳糖和乳果糖
吸取5.00mL滤液于10mL容量瓶中, 加入50μL的β-D-半乳糖苷酶悬浮液, 混匀后加盖。在40℃水浴或干燥箱培养至少10 h。
2.4 葡萄糖氧化
依次加入2.0mL  缓冲液C、100μL葡萄糖氧化酶悬浮液、1 滴辛醇、0.5mL  浓度为0.33mol.L -1氢氧化钠溶液、50 μL 过氧化氢和0.1 mL  过氧化氢酶悬浮液, 每加入一种试剂均要摇匀。全部溶液加完后, 在40℃水浴或干燥箱中培养3 h。冷却后稀释至10mL , 过滤, 弃去最初的1mL～2mL滤液, 收集滤液。
2.5 空白
依照2.1到2.4步骤处理空白溶液, 但不加β-D-半乳糖苷酶悬浮液。
2.6 测定
    在石英比色皿中依次加入1.00mL缓冲液B,0.100mLATP溶液,0.100mLNADP溶液,1mL滤液和1mL水, 每加入一种试剂均要摇匀.混合均匀后，静置3min.加入20μL混酶.混合均匀后上机,并同时做试剂空白.
  反应过程大约10min,每隔1min记录一次吸光度的变化,等两次吸光度不再变化,反应停止。此过程中吸光度的变化见表1
表1 加入混酶后反应吸光度的变化情况
时间/min    吸光度/Abs    时间/min    吸光度/Abs
1    0.113    7    0.208
2    0.168    8    0.215
3    0.174    9    0.220
4    0.182    10    0.230
5    0.195    11    0.232
6    0.202    12    0.232
等反应到达终点后,记录下吸光度。加入20μL磷酸葡萄糖异构酶悬浮液,混合均匀后上机。
反应过程大约15min,每隔1min记录一次吸光度的变化,等两次吸光度不再变化,反应停止.此过程中吸光度的变化见表2.
表2 加入磷酸葡萄糖异构酶后反应吸光度的变化情况
时间/min    吸光度/Abs    时间/min    吸光度/Abs
1    0.232    7   
2    0.385    8    0.758
3    0.468    9    0.776
4    0.557    10    0.782
5    0.649    11    0.786
6    0.732    12    0.786
2.7结果计算
2.7.1吸光值差
样品吸光值差△As的计算:△As = As2-As1
空白吸光值差△Ab的计算:△Ab= Ab2- Ab1
样品净吸光值差△AL的计算:△AL=△A s-△A b
2.7.2乳果糖含量
乳果糖的含量以样品的质量浓度c 计, 数值以
毫克每升(mg/L) 表示, 按下列公式计算:

式中:
△AL-样品净吸光值差；ML-乳果糖的摩尔质量( 342.3 g/mol)；ε-NADPH 在340 nm 处的摩尔吸光值( 6.3 L.mmol-1.cm-1) ；V1-比色皿液体总体积, V1=3.240mL ；V2-比色皿中滤液的体积, V2=1.00mL；d -比色皿光通路长度, d = 1.00cm；V-测试样体积( L) 。
计算结果精确到小数点后一位。
3 结果与讨论
3.1最大吸收波长的选择
在光谱模式下，测定标准系列的光谱图，仪器条件见表3。
表3 仪器条件
波长扫描范围/nm    420~650
光谱带宽/nm    0.5
采样间隔    0.5
扫描速度    中速
在此仪器条件下，扫描出标准系列的吸收光谱图，见图1。

图1 标准系列的吸收光谱图
由以上标准系列的吸收光谱图可知，乳果糖的最大吸收波长为540nm，与国标方法的一致。
    在样品测定过程中，同样做光谱扫描，结果见图2。图中实线为样品吸收光谱图，虚线为标准溶液吸收光谱图。从图中可以看出，样品和标准溶液的峰形基本吻合，最大吸收波长一致，基本不存在干扰对测定结果的影响。

图2 乳果糖样品吸收光谱图
3.2精密度试验
在重复性条件下获得六次独立测定结果，其标准偏差S和相对标准偏差见表4。
表4 精密度试验结果 n=6
样品
编号    测定值范围
mg/L    平均值
mg/L    标准偏差
S    相对标准偏差RSD
1    430.9~438.0    434.7    2.477    0.006
2    525.8~534.4    529.8    2.958    0.006
3    722.3~746.8    735.0    9.294    0.013
4    808.5~823.4    816.0    5.348    0.007
3.3回收率试验
本试验采用浓度为984 mg/L的乳果糖标准溶液进行加标回收。分别添加10.00、15.00、20.00、25.00mL的标准溶液进行试验，其结果见表5。
表5样品测定及加标回收试验

样品
编号    本底值
mg/L    加标量
mg/L    加标测定值
mg/L    回收率
%
1    217.35    98.4    311.2    95.38
2    264.90    147.6    392.3    86.31
3    367.50    196.8    541.8    88.57
4    408.00    246.0    634.5    92.07
4结论
    试验表明：本方法准确性高，重现性好，相对标准偏差在0.006~0.013之间，加标回收率在86.31%~95.38%之间，适用于灭菌乳中乳果糖的测定。
参考文献：
[1] 中华人民共和国农业行业标准 NY/T939-2005.巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定
[2] 黄萌萌，王加启等，牛奶乳果糖的研究进展[J]，中国乳品工业，2007，35（6）：54~57.
[3] 黄萌萌，王加启等，UHT灭菌乳贮存期间乳果糖的变化规律[J]，中国乳品工业，2007，35（12）：10~12.
[4] 黄萌萌，王加启等，牛乳中乳果糖含量测定的快速酶法[J]，中国农业大学学报，2007 ,12 (5) ：57~60

紫外分光光度法测定灭菌乳中乳果糖的含量