大肠杆菌计数-检验步骤 GB/T4789.38-2008)
第一法大肠杆菌MPN 计数
6、 操作步骤
6.1、 样品的稀释
6.1.1、 固体和半固体样品:以无菌操作取259 样品,置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内,8000r / min ~1000r/ min 均质1 min~2 min ,制成l:10 样品匀液,或置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min 制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、 液体样品:以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)中,充分振摇,制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、 样品匀液的pH 值应在6.5~7.5 之间,必要时分别用1mol/L 氢氧化钠(NaOH)或1mol/L 盐酸(HCI)调节。
6.1.4、 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ,沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打,使其棍合均匀,制成1:100 的样品匀液。
6.1.5、 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15 min 。
6.2、 初发酵试验
每个样品,选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液)。每个稀释度接种3 管月桂基磺酸盐胰蛋白陈(LST )肉汤,每管接种1 mL(如接种量超过1 mL ,则用双料LST 肉汤)。36℃±1℃ 培养24h±2h ,观察小倒管内是否有气泡产生,如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h~48h 内产气的LST 肉汤管数。如所有LST 肉汤管均未产气,即可报告大肠杆菌MPN 结果;如有产气者,则进行复发酵试验。
6.3、 复发酵试验
用接种环分别从所有培养48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中取培养物1 环,移种于已提前预温至45 ℃ 的EC 肉汤管中,放人带盖的44.5℃ ±2 ℃ 水浴箱内。水浴的水面应高于肉汤培养基液面,培养24h±2h ,检查小倒管内是否有气泡产生,如未产气则继续培养至48h ±2h 。记录在24h 和48h 内产气的EC 肉汤管数。如所有EC 肉汤管均未产气,即可报告大肠杆菌MPN 结果;如有产气者,则进行EMB 平板分离培养。
6.4、 伊红美蓝平板分离培养
轻轻振摇各产气管,用接种环取培养物划线分别接种于EMB 平板,36 ℃ ±1 ℃ 培养18h~24h 。检验平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
6.5、 营养琼脂斜面或平板培养
从每个平板上挑5 个典型菌落,如无典型菌落则挑取可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面或平板上,36 ℃ ±1 ℃ ,培养18h~24h 。取培养物进行革兰氏染色和生化试验。
6.6 、生化试验
6.6.1、 靛基质试验:将培养物接种蛋白陈水,36 ℃±1℃ 培养24h±2h 后,加Kovacs 靛基质试剂0.2 mL~0.3 mL ,上层出现红色为靛基质阳性反应。
6.6.2 、MR -VP 试验:将培养物接种MR -VP 培养基,36 ℃ ±1 ℃ 培养48h±2h 。移取培养物1mL至13 mm×100mm 试管中,加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 %氢氧化钾溶液0.2mL 和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h ,如出现伊红色,为VP 试验阳性。
将MR 一VP 培养液的剩余部分再培养48h 后滴加5 滴甲基红指示剂。培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
6.6.3、 柠檬酸盐利用试验:将培养物接种Koser 氏柠檬酸盐肉汤,36℃±1 ℃ 培养96h±2h,记录有无细菌生长。
6.7、 大肠杆菌MPN 计数的报告
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵乳糖、产酸、产气,IMViC 生化试验为++- -或-+- -。只要有1 个菌落鉴定为大肠杆菌,其所代表的LST 肉汤管即为大肠杆菌阳性。依据LST 肉汤阳性管数查MPN 表,报告每克(或毫升)样品中大肠杆菌MPN 值。