4.净化样品
用溶剂溶解的样品,多数组分在一定的时间内能完全从柱中流出来,不会造成危害。
有些样品可能含有微粒物质,样品中的某种组分(如蛋白质)在柱头上沉积下来,组分在固定相上保留很强,溶剂带走柱填料,等等,这些都会造成柱效能下降或柱寿命的影响,有必要采取措施防止柱变坏。
如在光线照射下观察样品是浑浊的或带有乳白色,进样前必须要过滤。虽然流路上装有过滤器和保护柱,但不能代替样品的前处理,样品中过多的微粒会使过滤器和保护柱超载,很快阻塞,或者微粒进入分析柱,所以在进样前必须过滤样品。
若怀疑样品与流动相混合有沉淀而对色谱柱有阻塞,应先试验一下,看样品溶液加入流动相中有无变浑或乳白色出现。如果进样后压力突然增加而后又慢慢减小,表明样品中有微粒或发生沉淀。如有沉淀要设法改变分离条件,包括换样品溶剂和流动相;或处理样品去掉不溶物质。应尽量用小体积的样品。
有些样品能很强地吸附在柱填料上,这样会降低塔板数,改变样品的保留时间、峰形,并且使得基线变差。除了用预处理的方法除去强保留物质外,还要加保护柱,定期清洗色谱柱。有时因为疏忽,用对柱有害的溶剂溶解样品,比如用6mol/L的氢氧化钠溶解样品,这样的样品只要进50~100μL到硅胶基质柱中,硅胶就很快溶解而使柱报废。在这种情况下,应立即中和样品,或除去原溶剂中的有害成分。
5.用强溶剂定期冲洗柱
每次工作结束,用强溶剂冲洗柱是良好的习惯。可用甲醇、乙腈冲反相柱,冲去留在柱上的强吸附组分。用甲醇/水为流动相时也应冲洗。冲洗的程序在以下章节中介绍。
柱头的烧结不锈钢滤片,要求平整,死体积小,孔径适当(2~5μm)。过滤片选择不好会改变色谱峰形,增加阻力或起不到阻挡污染物的作用(填料很快变色)。
此外,对柱硬件的保养也不可忽视。实际操作中应注意以下几点:1 接头要配套,用同一厂商的组接件;2 接头之间、柱压帽螺母与密封卡磁之间无微粒(填料),否则收紧时容易咬死;3 密封卡套与柱管一次性卡紧后再也不能松动,所以拆开柱头再上紧时要小心,不能使卡套移动,原来柱端的不锈钢滤片和垫片的厚度和强度也不能改变(改变这些附件的性能就促使卡套移动);4 接头等组接件不要拧得过紧,适当上紧后接上泵试验,分步拧紧,直到不漏为止。还有非常重要的是柱硬件的损坏往往会造成不可挽回的损失。